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背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的老年中枢神经系统疾病,主要引起患者神经紊乱、记忆力减退、行为和社交功能异常及认知能力减弱,病程呈慢性进行时,随着病程的延长,病情逐渐加重,直至完全丧失独立生活能力。AD特征性病理变化表现为细胞外老年斑,神经细胞内神经元纤维缠结,以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。尽管AD发病机制还未有明确报道,但大量研究表明β-淀粉样(Aβ)蛋白沉积诱导的神经炎症及细胞凋亡在AD的发生发展过程中起着十分重要的作用。micro RNA(简称mi RNA)是一种内生且高度进化的非编码小RNA,长度约为20-24个核苷酸。mi RNA通过与靶m RNA3’端非编码区(UTR)发生互补配对使m RNA降解或翻译过程受到抑制,mi RNA137位于人染色体1p22位置,在中枢神经系统尤其是海马齿状回及分子层中含量丰富,影响大脑可塑性及新生神经元的产生。mi RNA在许多疾病中发挥着重要作用,尤其是在肿瘤及神经系统疾病中意义重大,它可以通过调控神经元的成熟诱导精神分裂症的发生,同时与AD患者发病关系极为密切。肿瘤坏死因子相互作用蛋白(TNFAIP1)是第一个被鉴定的脐带血管内皮细胞中能受TNF-α和IL-6诱导的蛋白,属于PDIP1家族,含有N端BTB/POZ和C端PCNA结构域。TNFAIP1蛋白可分布在细胞质和细胞核中,在不同的组织中的表达存在差异性,是维持正常细胞生长必须的。TNFAIP1蛋白结构具有高度保守性,主要参与DNA的复制,DNA修复和细胞凋亡等过程,在AD发生发展中起着十分重要的作用,但目前缺乏有力证据来阐述mi R-137及TNFAIP1在AD发生中的致病机制。目的本课题研究Aβ对mi R-137及TNFAIP1表达水平的影响,并对mi R-137的靶基因进行预测及验证,同时分析mi R-137过表达对Aβ诱导的神经毒性的影响以及mi R-137靶向结合TNFAR1抑制Aβ诱导的神经毒性作用机制。旨在了解mi R-137在Aβ诱导的神经毒性作用机制,进而为AD靶向治疗提供可靠依据。方法(1)设计并合成mi R-137、TNFAIP1、U6、GAPDH特异性引物,将不同浓度的Aβ25-35(0,5,10,20μM)加入皮质神经元细胞及N2a细胞中培养构建Aβ体外培养模型,采用q RT-PCR方法对Aβ25-35作用下细胞中mi R-137及TNFAIP1 m RNA表达水平进行分析,采用Westernblot法对TNFAIP1蛋白表达水平进行分析。(2)利用生物信息学软件分析mi R-137的靶基因,构建了pmir GLO-TNFAIP1-3’UTR-WT和pmir GLO-TNFAIP1-3’UTR-MUT重组质粒,并将重组质粒及mi R-137共转染到239TN细胞中,采用荧光素酶双报告基因法检测细胞中荧光素酶活性;采用q RT-PCR方法对mi R-137转染组、anti-mi R-137转染组、mi R controls转染组、anti-mi R controls转染组皮质神经元及N2a细胞中TNFAIP1 m RNA表达水平进行分析;采用Westernblot法对不同组细胞中TNFAIP1蛋白表达水平进行分析。(3)将mi R-control及mi R-137转染N2a细胞,采用q RT-PCR测定细胞中mi R-137表达水平。随后分别在mi R-control及mi R-137转染组中加入不同浓度的Aβ25-35,培养24 h后,分别采用MTT法、流式细胞术、Caspase比色法及ELISA法测定不同转染组及不同Aβ25-35浓度作用下细胞活性,细胞凋亡率,Caspase活性及NF-?B活性的变化;采用Westernblot法对NF-?B蛋白表达水平进行分析。(4)分别将si-control及si-TNFAIP1转染N2a细胞,采用Westernblot测定细胞中TNFAIP1蛋白水平的相对表达量。随后将实验分为阴性对照组(NC组)及si-control、si-TNFAIP1、mi R-control、mi R-137、mi R-137+pc DNA3.1、mi R-137+pc DNA-TNFAIP1转染N2a细胞组,NC组细胞中加入PBS缓冲液,其他各组分别加入20μM的Aβ25-35,培养24h后,采用分别采用MTT法、流式细胞术、Caspase比色法及ELISA法测定不同转染组细胞活性,细胞凋亡率,Caspase活性及NF-?B活性的变化。结果(1)q RT-PCR检测结果显示,随着Aβ25-35浓度的增加,皮质神经元及N2a细胞中mi R-137相对表达水平与未加入Aβ25-35组相比显著降低(P<0.05);TNFAIP1 m RNA和蛋白表达水平与未加入Aβ25-35组相比显著增加(P<0.05)。(2)生物信息学软件预测结果表明,TNFAIP1是mi R-137的一个靶基因。荧光素酶检测结果显示,与对照组相比,mi R-137与TNFAIP1-3’UTR-WT共转染组的荧光素酶表达量明显降低(P<0.05);而mi R-137与TNFAIP1-3’UTR-Mut共转染组细胞中的荧光素酶表达量则与对照组相比无显著差异(P>0.05)。q RT-PCR检测结果显示,与对照组相比,mi R-137转染组细胞中mi R-137相对表达量显著升高(P<0.05);anti-mi R-137转染组细胞中mi R-137相对表达量显著降低(P<0.05)。q RT-PCR和Westernblot检测结果显示,皮质神经元和N2a细胞中mi R-137转染组TNFAIP1 m RNA和蛋白水平相对表达量与mi R-control组相比显著降低(P<0.05),anti-mi R-137转染组TNFAIP1 m RNA和蛋白水平相对表达量较anti-mi R-control组显著增加(P<0.05)。(3)MTT法检测结果显示,随着Aβ25-35浓度的增加,两组细胞活性均逐渐降低,但Aβ25-35浓度为10μM及20μM时,mi R-137转染组与mi R-control转染组相比细胞活性明显较高(P<0.05)。流式细胞术和Caspase-3比色法检测细胞凋亡情况结果显示,随着Aβ25-35浓度的增加,mi R-137组及mi R-control组细胞凋亡率及Caspase-3活性逐渐升高,但与对照组相比,mi R-137组细胞凋亡率及Caspase-3活性较低(P<0.05)。ELISA测定NF-?B活性结果显示,随着Aβ25-35浓度的增加,mi R-137组及mi R-control组NF-?B活性逐渐升高,但与对照组相比,mi R-137组NF-?B活性较低(P<0.05)。(4)Westernblot法检测结果显示,si-TNFAIP1转染组细胞中TNFAIP1蛋白相对表达量明显下降;pc DNA-TNFAIP1转染组N2a细胞中TNFAIP1蛋白相对表达量明显升高。MTT法检测结果显示,Aβ25-35作用后细胞活性明显降低,si-TNFAIP1组与mi R-137过表达组能够逆转Aβ25-35对细胞活性的抑制(P<0.05),mi R-137+pc DNA-TNFAIP1组细胞活性与mi R-137+pc DNA3.1组相比明显较低(P<0.05)。流式细胞术及Caspase-3比色法检测细胞凋亡情况结果显示,si-TNFAIP1组及mi R-137过表达组能明显逆转Aβ25-35对细胞凋亡的促进作用(P<0.05);mi R-137+pc DNA-TNFAIP1组细胞中胞凋亡率及Caspase-3活性与mi R-137+pc DNA3.1组相比较高(P<0.05)。ELISA测定NF-?B活性结果显示,Aβ25-35可使NF-?B活性增强,si-TNFAIP1组及mi R-137过表达组能明显逆转Aβ25-35对NF-?B活性的促进作用(P<0.05),而TNFAIP1过表达可明显解除si-TNFAIP1及mi R-137对NF-?B活性的抑制作用(P<0.05)。结论Aβ25-35能够抑制细胞中mi RNA的表达,促进TNFAIP1的表达。TNFAIP1是mi R-137的一个靶基因,mi R-137过表达通过靶向结合TNFAIP1激活NF-?B通路进而抑制Aβ25-35诱导的细胞毒性和细胞凋亡作用。