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研究背景:慢性阻塞性肺病是一种以不可逆的气流受限为主要特点的常见慢性病,主要表现为,主要表现包括慢性支气管炎和肺气肿。小气道是慢阻肺的主要病变部位,其发病机制尚未完全阐明,主要集中在炎症,氧化应激及蛋白酶-抗蛋白酶失衡等方面,目前慢阻肺治疗手段有限,主要以延缓疾病发展进程为主。NAPDH氧化酶是内源性ROS重要的来源之一,在人体多种组织上表达,但是目前关于NAPDH氧化酶是否参与急性吸烟引起的氧化和炎症反应尚无研究涉及。葛根是一种常用的中药,葛根素是其中主要的活性成分,具有抗氧化和抗炎作用,已证明对心脑血管系统疾病、糖尿病等疾病具有一定治疗效果。但葛根素抗氧化及抗炎症功能具体机制并不十分清楚,并且尚无既往研究验证其逆转急性香烟烟雾暴露引起的氧化应激和炎症反应。研究目的:1.本研究通过建立急性香烟烟雾暴露（ACS）小鼠体内模型,以及香烟烟雾提取物（CSE）处理的人小气道上皮细胞（HSAECs）体外模型,通过检测ROS（包括超氧化物和过氧化氢）的产生,肺组织和肺泡灌洗液组织细胞形态学检查,分子生物学等多种方法检测NAPDH氧化酶,NF-κB通路以及TNF-α,COX-2和IL-8炎症蛋白的表达。通过急性香烟烟雾暴露的体内外模型探索急性氧化及炎症反应机制,重点探索急性香烟烟雾暴露引起的NAPDH氧化酶依赖的氧化和炎症反应的具体机制。2.通过观察葛根素对急性香烟烟雾暴露诱导的小鼠和香烟烟雾提取物（CSE）处理的人小气道上皮细胞（HSAECs）的氧化应激和炎症反应的缓解作用,并阐述其相关潜在的药理机制,从而为早期干预慢阻肺疾病发展进程提供新的思路。研究方法和结果:C57/6J分为正常组,ACS组（造模组）,葛根素组（40mg/kg及80mg/kg）及TEMPO组（ROS清除剂）。吸烟小鼠暴露于急性香烟烟雾中1小时,在ACS暴露后2、6、24小时分别收集肺组织,同时预先加入或不加入葛根素（40或80 mg/kg）处理。肺组织冰冻切片经DHE荧光探针染色,结果显示ACS暴露后2、6小时,葛根素剂量依赖性清除小鼠肺组织中ACS诱导产生的超氧化物。然后,通过ERS测定葛根素是否直接清楚超氧化物,结果显示在无细胞系统中葛根素对的超氧化物无直接缓冲作用。通过Western Blot检测葛根素对于ACS暴露小鼠肺组织中NOXs的调节作用,发现葛根素显著抑制ACS暴露小鼠肺部NOX1、2、4蛋白表达上调。肺组织切片H＆E染色和肺泡灌洗液吉姆萨染色分别显示CS暴露小鼠肺实质和肺泡灌洗液中炎症细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）明显增多。类似的,葛根素可显著减少ACS小鼠肺实质和肺泡灌洗液中炎症细胞的数量。通过RT-PCR检测出ACS引起的小鼠肺组织中炎症因子（TNF-α和KC）mRNA表达的上调,Western Blot检测到炎症蛋白（磷酸化p65,TNF-α和COX-2）表达的上调,而葛根素组小鼠肺组织中ACS引起的炎症因子（TNF-α和KC）mRNA表达,以及磷酸化p65,TNF-α和COX-2蛋白表达的上调均呈现出剂量依赖性的抑制。在体外实验中,CSE刺激的HSAECs通过DHE和DCFH-DA荧光探针染色检测,显示超氧化物和过氧化氢的产量随时间和浓度依赖性增加,而葛根素预处理组（20,40μM）的HSAECs中ROS剂量依赖型性下降。通过Western Blot检测到在CSE刺激的HSAECs中NOX1、2、4、5蛋白表达均上调,葛根素在CSE处理的HSAECs中显著逆转ROS的产生和NOX1、4的蛋白表达。此外,通过细胞免疫荧光检测到在CSE诱导的HSAECs中增加的RelA/p65核转位,而葛根素预处理组的RelA/p65核转位减少。通过ELISA检测出CSE增加了 IL-8在培养基中的分泌,并且Western Blot检测到在HSAECs中COX-2的蛋白表达上调。同样地,葛根素对CSE诱导的HSAECs中IL-8的分泌和COX-2的蛋白表达也呈剂量依赖性逆转效果。此外,ROS清除剂（TEMPO）在体内和体外都呈现出部分地逆转了ACS诱导的ROS的产生和COX-2的表达,并且葛根素组与葛根素联合TEMPO治疗组相比,对于急性吸烟导致的氧化和炎症反应没有额外的协同作用。研究结论:1)ACS和CSE可诱导小鼠和HSAECs的氧化应激和炎症反应,并且葛根素可大部分、剂量依赖性地消除急性吸烟引起的氧化和炎症反应;2)葛根素通过减少ACS暴露小鼠肺组织中NOX1,NOX2和NOX4蛋白表达的上调,以及CSE诱导的HSAECs中NOX1和NOX4蛋白表达的上调,导致活性氧减少,进而抑制炎症反应（炎症反应包括:包括肺实质炎症细胞计数增加和NF-κB通路激活,以及炎症蛋白COX-2表达上调）。总的来说,葛根素通过减轻ACS小鼠肺组织中NOX1,NOX2和NOX4蛋白表达的上调,以及CSE刺激的HSAECs中NOX1和NOX4表达的上调,从而抑制ROS的产生,减少ROS调控的NF-κB转录因子的激活,下调COX-2等炎症蛋白表达。这些数据支持葛根素可减轻急性香烟烟雾诱导的氧化和炎症反应,为早期干预慢性阻塞性肺病提供 了新的思路。