本文从以下两部分进行了阐述。　　产生绵羊诱导多能干细胞的研究。　　绵羊一直以来都是一种重要的家养动物。以绵羊作为研究材料进行体细胞重编程的研究由来已久，绵羊“多莉”就是人们通过体细胞核移植获得的第一只克隆哺乳动物。对绵羊进行基因修饰以改善其生长特性、抗病能力以及用其生产高品质贵重活性蛋白，已经在农业及生物医药领域得到了广泛的应用。然而，传统的转基因技术易导致外源基因的不正常表达，而且效率很低，这严重限制了基因修饰绵羊的应用。　　依赖胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs)的定点基因打靶技术已经在小鼠中成功运用并能高效准确地进行基因敲除或敲入。到目前为止，人们只在少数物种中建立了ES细胞系，如小鼠，人类，恒河猴及大鼠。然而，由于对其培养条件缺乏了解，建立并维持绵羊等有蹄类动物的ES细胞系非常困难。因此，虽然人们经过几十年的努力，真正的绵羊ES细胞系仍尚未被建立。　　2006年，Yamanaka实验室利用逆转录病毒作为载体将外源的四种转录因子（Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4）导入小鼠成纤维细胞，迫使小鼠成纤维细胞“重编程”，逆转至多能干细胞状态。此后，研究者又用类似的方法相继建立了人，猴，大鼠和猪的诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell，iPSC)系。研究证明小鼠的iPS细胞可以高效嵌合到生殖系，并可以进行基因操作。因此，iPS技术对于难以建立胚胎干细胞系的动物细胞无疑提供了一种可能的替代方案。　　我们利用可诱导（RevTet-on系统）的慢病毒表达系统分别表达8个因子:Oct4，Sox2，Klf4，C-myc，Nanog，Lin2，hTERT以及SV40 large T来诱导绵羊耳尖成纤维细胞重编程为iPS细胞。我们证明产生的iPS克隆为碱性磷酸酶阳性。同时这些iPS克隆也都特异表达干细胞特异性抗原SSEA-1，Tra-1-60，Tra-1-81，OCT3/4，NANOG，SOX2，REX1和CDH1。进一步的基因表达分析显示在绵羊iPS形成过程中，内源的Nanog等关键转录因子被激活，并具有正常的核型。为验证其多能性，将得到的绵羊iPS细胞进行体外分化实验，结果显示其形成拟胚体，并具有分化为所有三胚层的潜能。同时，绵羊iPS细胞产生的畸胎瘤中也包含所有三胚层的组织。　　今后，绵羊iPS可以被用于探索重编程的机理，并且将有助于寻找维持绵羊ES细胞的条件进而建立绵羊ES细胞系。这些细胞也可能被直接用于基因打靶并通过体细胞核移植的方法获得基因修饰绵羊。　　锌指核酶介导的GGTA1基因敲除克隆猪的研究。　　猪被认为是最适合作为人类疾病模型以及提供异种移植器官的物种之一。基因修饰猪已经被证明能成功地模拟人类疾病的症状以及降低猪-人器官移植的免疫排斥。然而，传统的基于同源重组(homologous recombination，HR)基因打靶技术只在ES细胞中才有较高的效率。到目前为止，真正意义上的猪ES细胞系尚未被建立。HR在体细胞中效率极低，这成为产生转基因猪的主要障碍。近几年，锌指核酶(Zinc-finger nuclease)技术被证明在定点修饰基因组中非常有效，并成功地在果蝇，斑马鱼，小鼠，大鼠以及人类细胞中得到了应用。　　绝大多数哺乳动物的细胞膜上都存在α-1，3-半乳糖基（α-1，3-galactosyl，Gal）抗原表位。但人类和旧世界猴中没有Gal，并且在血液中存在抗Gal的抗体。因此，猪的器官移植到人体内会导致超急性排斥(hyperacute rejection response，HAR)，这是猪-人移植的主要障碍。Gal表位由α-1，3-半乳糖苷转移酶(α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1)催化产生。因此，为了去除异种抗原，人们已经使用传统方法敲除了猪的GGTA1基因。移植实验也表明，GGTA1敲除猪的实体器官移植到狒狒体内可以显著改善其存活状态。但是HR敲除技术的效率很低，并且会引入外源的抗药基因。　　我们试图使用ZFN技术在猪中敲除GGTA1基因。我们使用识别GGTA1编码区的ZFN转染猪的原代成纤维细胞，经过药物筛选后获得了18个单拷贝敲除和4个双拷贝敲除的细胞克隆，效率分别为23.4％和5.2％。随后我们用获得的双拷贝敲除的细胞通过体细胞核移植产生克隆猪，一共获得了3头GGTA1双拷贝敲除的克隆猪，并且从克隆胎儿中建立了一个双拷贝敲除的原代成纤维细胞系。GGTA1敲除猪的细胞膜中Gal表位被完全清除。免疫学实验表明，GGTA1敲除能够保护克隆猪细胞与人血清共培养时不会受到补体介导的免疫攻击。　　我们的研究证明了ZFN在产生基因修饰猪中非常有效。GGTA1敲除的猪以及胎儿成纤维细胞将为人-猪器官移植的研究提供重要的工具。