【摘 要】
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目的:本课题基于CRISPR/Cas9突变体Cas9 D10A单切口酶可以对DNA双链中单链的特定位置进行切割的原理,通过对重组底物载体中含适配体序列链的互补链两特定位置进行双单切口酶剪切,而适配体序列部分保持与载体的连接完整性,继而探究构建一种新的“靶向表达载体”的方法。这种适配体-质粒靶向表达载体既具有适配体靶向性又具有质粒携带功能表达基因的特性,从而为未来实现安全、高效、经济的非病毒生物核酸
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目的:本课题基于CRISPR/Cas9突变体Cas9 D10A单切口酶可以对DNA双链中单链的特定位置进行切割的原理,通过对重组底物载体中含适配体序列链的互补链两特定位置进行双单切口酶剪切,而适配体序列部分保持与载体的连接完整性,继而探究构建一种新的“靶向表达载体”的方法。这种适配体-质粒靶向表达载体既具有适配体靶向性又具有质粒携带功能表达基因的特性,从而为未来实现安全、高效、经济的非病毒生物核酸链载体自主靶向诊治功能的设想提供前期技术和方法指导。方法:1.构建两种重组载体,首先设计并合成两端具有特定序列的适配体延长序列及其互补序列,退火形成双链,用T4 DNA连接酶与用Kpn I和Xba I双酶切胶回收的PX461载体和PX461-sg RNA1+2线性载体分别连接,构建出双RNA引导的单切口酶的重组载体底物和双sg RNA与Cas9D10A单切口酶共表达自剪切载体。2.RNP1（Cas9 D10A+sg RNA1,RNP1）和RNP2（Cas9 D10A+sg RNA2,RNP2）复合物细胞外对底物载体剪切验证。3.在293T细胞中先后转染PX461-END重组底物载体和双RNP复合物进行细胞内剪切验证。4.转染293T细胞PX461-sg RNA1+2-END共表达自剪切载体进行细胞内自身剪切验证。通过琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应（PCR）、用纳米DNA探针间接检测剪切开的短链、一代测序技术验证剪切后的产物。结果:1.成功构建了PX461-END和PX461-sg RNA1+2-END两个重组载体。2.细胞外双RNP复合物对重组载体PX461-END剪切后的产物,呈现出琼脂糖凝胶成像下可见的剪切结果条带,进一步对包含剪切处目的片段部位进行PCR扩增,结果显示对照组为目的大小单条带,实验组条带为双带,在目的大小条带下方有条亮度较弱的带,推测有可能双RNP复合物在细胞外存在有效的目的剪切。剪切产物退火及纯化处理后加T4 PNK和T4 DNA连接酶,PCR扩增的目的片段琼脂糖凝胶结果各组条带单一。剪切断开的短单链DNA用相应纳米探针检测,结果剪切产物组和空白组荧光信号一致,阳性对照组出现较强的荧光信号。3.在293T细胞内双RNP复合物对预先转染进去的重组质粒PX461-END剪切后用质粒小提试剂盒提取质粒DNA,PCR扩增包含剪切处目的片段,实验组和对照组比较有双带,同样较小条带亮度亦比较弱。4.共表达自剪切载体PX461-sg RNA1+2-END转染293T细胞后,同样提质粒后PCR扩增剪切处目的片段,实验组琼脂糖凝胶成像结果未出现明显可见双带,与阳性对照组一致。以上细胞外双RNP复合物剪切产物及所有PCR扩增的目的片段均测序,正向测序结果均包含适配体序列,反向引物测序结果包含适配体的互补序列,未出现预期剪切的测序结果。结论:本研究中成功构建了双Cas9 D10A单切口酶剪切底物重组载体,通过应用高效定点基因编辑技术,探究了构建适配体（endoglin）和质粒（PX461）“靶向表达载体”的方法,采用的方法和得出的结果可为“靶向表达载体”的进一步研究提供实验依据和指导。
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