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轮状病毒作为呼肠孤病毒属的双链RNA病毒,是世界范围内引起婴幼儿急性肠胃炎的主要病原体。轮状病毒主要感染小肠上皮细胞。已有证据证明固有免疫反应作为第一道防线,能够抑制轮状病毒在宿主内复制和发病。并且,固有免疫反应对于适应性免疫的强度和持久度的保持非常重要。当轮状病毒感染宿主时,首先,会触发第一道防线,主要诱发一些细胞因子以及某些趋化因子的表达。干扰素(IFNs)是主要的细胞因子,对固有免疫抵抗外源病原体的侵入有着非常的作用。到目前为止,IFNs可以被分成三种类型。Ⅰ型IFNs,包括IFN-α和IFN-β,它们是宿主抗病毒感染的关键成分,它们具有强大的抗病毒特性。Ⅱ型 IFNs,包括 IFN-γ。研究表明 Ⅲ型 IFNs(IFN-λ),包括 IFN-λ(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)和IFN-入4,它们在固有免疫中也发挥重要的作用。Ⅲ型IFNs(IFN-λ)在控制轮状病毒感染的作用比Ⅰ型IFNs更加重要。轮状病毒诱导Ⅲ型IFNs分泌的可能涉及许多基因,随着轮状病毒感染,RLRs(RIG-I/MDA5)可以识别它的dsRNA,然后刺激一系列的下游级联反应,导致Ⅲ型IFNs的诱导表达。许多相关基因都参与此过程,包括RLRs及其衔接蛋白(MAVS)和IRFs.为了探究轮状病毒感染对RLRs(RIG-I和MDA5)及其衔接蛋白(MAVS)、IRFs以及IFN-λ的蛋白表达水平有何影响。我们使用In-cell western Assay方法定量这些基因的蛋白相对表达量。分离自本实验室轮状病毒株CC0812-1以0.6TCID50/cell滴度感染铺于96孔细胞板内的肠上皮细胞系HT29,NC组用PBS感染。分别在感染的6h、12h、18h和24h时用3.7%的甲醛固定细胞,随后用TritonX-100透化细胞,非特异性蛋白则使用5%脱脂奶粉进行封闭,细胞孵育用PBS稀释的一抗过夜,最后孵育PBS稀释的荧光二抗与DRAQ5。实验结果表明,RIG-I和MDA5在6hpi,轮状病毒感染下调了其基因的相对表达量,但是随着时间的推移,12hpi,18hpi和24hpi,轮状病毒感染上调了其基因的相对表达量。在6hpi,12hpi,18hpi和24hpi时,轮状病毒感染上调了 MAVS基因的相对表达量。仅在18hpi和24hpi时IRF1相对表达量因为轮状病毒的感染而变化,在18hpi上调,与24hpi下调。对于IRF3基因,在6hpi和18hpi,相对表达量并没有因为轮状病毒的感染而发生变化,但是在12hpi和24hpi时,基因的相对表达量都因为轮状病毒的感染而下调。IRF7在12hpi和18hpi时因为轮状病毒的感染而上调,但是在24hpi时下调。IRF9基因仅在轮状病毒感染的24h时下调,在6hpi,12hpi和18hpi没有变化。为了计算IFN-λ1(IL-29)的表达量,我们使用活化的轮状病毒CC0812-1感染肠上皮细胞HT29,感染的滴度为0.6TCID50。在6hpi,12hpi,18hpi和24hpi分别收获仅含DMEM basic的细胞维持液。使用Human IL-29 ELISA Kit计算IL-29的含量。结果显示,在 6hpi 时 IFN-λ1(IL-29)的含量增加了 6.67 倍,12hpi 时 7.25 倍,18hpi 时 16.39 倍以及24hpi时 1.78倍,IFN-λ1(IL-29)在 18hpi是达到高峰,为 1049.40ng/mL。在6hpi时为727.10 ng/mL,12hpi为790.50 ng/mL,24hpi为337.35 ng/mL。通过以上实验结果,我们发现轮状病毒感染对RLRs(RIG-I和MDA5)及其衔接蛋白(MAVS)、IRFs以及IFN-λ的蛋白表达水平有着非常重要的影响。