【摘 要】
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泛素-蛋白酶体系统是胞内蛋白质的主要降解途径,并且通过调节其下游底物的泛素化降解,参与许多细胞过程。泛素化反应失调会引起细胞功能的紊乱,从而促进肿瘤的发生和发展。泛素连接酶Nedd4在多种肿瘤细胞中高表达,并在癌症的发生和发展中起着关键作用。通过泛素连接酶Nedd4介导的自泛素化为相关疾病的治疗开辟了新思路。因此,筛选Nedd4的小分子抑制剂,并对其作用机制和生理功能进行研究,能够为药物研发提供新
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泛素-蛋白酶体系统是胞内蛋白质的主要降解途径,并且通过调节其下游底物的泛素化降解,参与许多细胞过程。泛素化反应失调会引起细胞功能的紊乱,从而促进肿瘤的发生和发展。泛素连接酶Nedd4在多种肿瘤细胞中高表达,并在癌症的发生和发展中起着关键作用。通过泛素连接酶Nedd4介导的自泛素化为相关疾病的治疗开辟了新思路。因此,筛选Nedd4的小分子抑制剂,并对其作用机制和生理功能进行研究,能够为药物研发提供新策略。本研究首先构建泛素激活酶UBE1的原核表达质粒,然后通过大肠杆菌表达并纯化获得UBE1蛋白。建立了泛素连接酶Nedd4的体外自泛素化筛选体系,确定泛素激活酶UBE1的浓度为20 n M,泛素结合酶Ubch5c的浓度为70 n M,泛素连接酶Nedd4的浓度为160 n M,泛素化反应时间为40 min。然后,利用泛素连接酶Nedd4的体外自泛素化筛选体系对348种小分子化合物进行筛选,获得S4105和S4355两种泛素连接酶Nedd4的小分子抑制剂,S4105和S4355可以有效抑制泛素连接酶Nedd4的自泛素化过程;最后,通过MTT、Ed U、划痕和流式细胞术等实验研究S4105和S4355的抗肿瘤作用,研究发现,S4105可以抑制He La细胞的细胞活力、细胞增殖、细胞迁移,并促进细胞自噬和细胞凋亡,从而发挥肿瘤作用;而S4355主要是通过抑制细胞活力、细胞增殖和细胞迁移发挥抗肿瘤作用。综上所述,本论文建立了Nedd4体外自泛素化筛选体系,获得两种Nedd4小分子抑制剂,功能研究发现,Nedd4小分子抑制剂可以抑制肿瘤的发生和发展,这为开发新一代抗肿瘤药物奠定基础。
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