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人类T细胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)是成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)的致病病原。HTLV-1病毒除了编码病毒结构基因gag、pol和env外,还编码一系列调节基因Rex、p12、p13、p30、Tax和HBZ等。其中Tax蛋白是HTLV-1病毒编码的最为重要的蛋白,它能参与调控细胞内的多条信号通路,如TGF-β/Smad,AP-1,NF-κB,AKT,Wnt等,从而促进肿瘤的发生。然而Tax蛋白调控ATL细胞恶性增殖促进ATL发生的分子机制尚未完全阐明。Hippo/YAP信号通路最初发现于果蝇体内,在哺乳动物中Hippo/YAP信号通路各个组分高度保守,主要具有调控胚胎发育,器官大小的作用。在肿瘤发生过程中,肿瘤细胞通过多种调控机制促进Hippo通路下游YAP蛋白的过表达,同时抑制Hippo通路功能,最终促进细胞的恶性增殖。据此,我们推测在ATL细胞中Tax蛋白是否同样通过调控Hippo/YAP信号通路,从而影响了成人T细胞白血病的发生呢?为了证实这一推测,本课题主要分析了Tax蛋白对Hippo/YAP信号通路的调控作用,进一步研究了该调控功能的潜在分子机制及生理意义。主要研究内容如下:第一部分:Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中受到抑制为了探究Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中的激活情况,我们对Hippo/YAP信号通路下游关键蛋白YAP的蛋白水平,基因水平,细胞核内定位及下游靶基因的表达情况进行检测分析。首先通过RT-PCR及Western Blot实验发现相对于对照组细胞(PBMC、PHA刺激后的PBMC细胞),ATL细胞株(ATL-T、ATL-2、MT-4、MT-2、MT-1、TL-Om1、ED)中YAP基因及蛋白均存在不同程度的高表达。随后我们进行了免疫荧光分析,结果显示相对于对照细胞株(Jurkat、Hut-78),ATL细胞株(ATL-T、ATL-2)中YAP蛋白主要分布在细胞核内。最后,我们实验结果显示在ATL细胞株中YAP下游与细胞增殖相关的靶基因,例如CTGF、cyr61、RASSF4、TIMP1存在异常表达。上述结果表明Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中受到抑制。第二部分:Tax促进YAP蛋白表达并激活其转录激活活性为了探究HTLV-1对Hippo/YAP信号通路及其关键蛋白YAP的调控作用,我们首先检测了HTLV-1关键蛋白Tax和HBZ对YAP蛋白表达的影响。运用HTLV-1感染性克隆实验发现HTLV-1病毒,尤其是HTLV-1编码的Tax蛋白可以促进YAP蛋白的表达,而HBZ则无任何作用。随后,我们进一步分析了Tax促进YAP表达的分子机制。我们克隆了YAP启动子及其突变体,运用双荧光素酶报告基因实验发现Tax能够激活YAP启动子活力,突变体分析发现Tax对YAP启动子的激活作用主要靶向YAP启动子-158至+117区域。进一步研究发现,Tax可以显著激活YAP介导的下游效应元件8×GTIIC-Luc的活性。以上结果证明Tax可以激活YAP的表达及功能,从而抑制Hippo/YAP信号通路。第三部分:Tax通过蛋白结合激活YAP蛋白功能的分子机制为了研究Tax调控Hippo/YAP信号通路的分子机制,我们首先通过免疫共沉淀实验发现Tax蛋白可以和YAP蛋白结合,且免疫荧光实验结果证实二者共定位在细胞核内。为了进一步分析两者的结合位点,我们运用YAP及Tax突变体进行免疫共沉淀分析,结果显示YAP蛋白主要通过YAP(1-174)或YAP(204-233)或YAP(263-292)结构域参与与Tax蛋白的互作。而Tax蛋白主要通过其(99-319)结构域介导与YAP蛋白的结合。进一步免疫荧光及Co-IP实验分析YAP在细胞内的定位,发现Tax可以促进YAP蛋白的入核,而Tax并不能抑制YAP与14-3-3的结合。随后我们通过免疫共沉淀实验发现Tax抑制了YAP与上游LATS1激酶的结合,并降低了YAP S127位磷酸化水平。此外我们运用Western Blot实验检测了Tax对YAP蛋白半衰期的影响。CHX及泛素化实验结果显示Tax可以抑制YAP蛋白的泛素化降解,并维持YAP蛋白的稳定性。以上结果表明Tax可以与YAP结合,且Tax可以抑制YAP与LATS1的结合以及YAP S127位磷酸化,从而促进了YAP的入核。此外,Tax还提高了YAP蛋白的稳定性,最终激活了YAP的转录激活功能。第四部分:YAP蛋白促进HTLV-1病毒侵染及ATL细胞的小鼠成瘤为了研究Tax是否可以通过调控Hippo/YAP信号通路影响ATL的发生,我们构建了高表达YAP和沉默YAP的稳定细胞株。研究发现沉默YAP可以显著抑制ATL-T细胞的恶性增殖。通过病毒侵染实验发现高表达YAP的ATL细胞株中HTLV-1病毒的侵染能力明显增强。高表达YAP的ATL-T细胞中,YAP下游与细胞生长、迁移正相关的基因,例如CTGF,FGF-1,C-MYC,NRP-1,HSPG出现明显上调。而RASSF4,TIMP1,BMP2等与细胞生长,迁移负相关靶基因,出现明显下调。最后,免疫缺陷小鼠实验发现,皮下注射沉默YAP的ED细胞后,小鼠形成实体瘤的大小及重量明显小于注射对照ED细胞的小鼠。基因检测也发现实验组小鼠中YAP下游与细胞生长正相关的靶基因也出现了明显下调。综上所述,本研究发现Hippo/YAP信号通路在ATL细胞中被抑制。HTLV-1编码的Tax蛋白通过与YAP互作抑制了YAP与LATS1的结合,从而抑制YAP S127位磷酸化,促进YAP的入核及功能。同时研究证明Tax可以通过激活YAP启动子的活力进而促进YAP蛋白的表达。此外,Tax还可以抑制YAP蛋白泛素化降解并提高YAP蛋白稳定性。最后,研究发现YAP可以促进HTLV-1病毒的侵染和ATL细胞的成瘤特性。在ATL细胞中过表达或沉默YAP可以影响YAP下游与生长、迁移相关靶基因的表达。本研究发现Tax通过调节Hippo/YAP信号通路促进ATL的发生。揭示了HTLV-1促进ATL发生的新分子机制,为ATL的诊断和临床治疗提供了新的靶点。