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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起,发病动物主要表现体温升高、瘙痒、急性脑脊髓炎和繁殖障碍等主要临床症状。该病危害各阶段的猪,给世界多国养猪业造成了重大的经济损失。美国和部分欧盟国家通过实施根除计划,净化了家猪的PR。在我国,随着PRV弱毒疫苗的使用,以及部分规模化种猪场实施PR的根除净化计划,PR得到有效的控制。但是自2011年10月以来,我国有超过20个省市区规模化猪场暴发了PR,许多免疫过PRV弱毒疫苗的猪场也有发病报道,这给我国PR的防控带来了巨大的挑战。为了深入了解此次PR重新暴发的原因,开展了以下研究工作:1.PRV的病原流行病学调查2012年1-11月,从我国多省市386家规模化猪场送检的1227份临床组织样品中检测出13.73%(53/386)的猪场存在着PRV野毒感染,12.47%(153/1227)的样品中存在着PRV野毒;其中4月,5月,11月送检的样品中PRV野毒的感染率都超过30.00%。选取8份PRV野毒感染的阳性样品,对其gB、gC、gE、TK、RR1、RR2等毒力和免疫原性相关基因分别进行测序、比对和进化树分析,结果显示,野毒株与Bartha株相比,g B、g C和RR1基因都存在氨基酸的缺失或插入突变,各基因同源性都比Ea株这些基因同源性低,各基因都不在同一进化分支。结果表明PRV野毒株与Ea株亲缘关系比Bartha株近。2.PRV的分离鉴定PRV野毒感染样品分别通过病毒的分离鉴定,测定其TCID50、一步生长曲线和病毒粒子的形态观察等研究,分离鉴定出PRV HNX、HNB、HNQZ、HNQX、HNZK株等5株病毒,其第1-9代病毒的TCID50为10-5.0-10-6.5/0.1m L,HNX株与Fa株生长趋势相似,病毒形态均为直径150nm左右,椭球形,有囊膜和纤突的粒子。3.PRV对小鼠的致病力研究PRV HNX、HNB、Ea、Fa株对6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为102.0TCID50、102.4TCID50,102.0TCID50、100.7TCID50;同剂量感染小鼠,HNX株和HNB株感染的小鼠在短时间内出现严重瘙痒等临床症状,能引起小鼠脑组织小胶质细胞增多,神经元变性坏死等严重的病理损伤。4.HNX株对PRV Bartha株母源抗体仔猪的致病力研究HNX株和Ea株分别颈部肌肉注射含有Bartha株母源抗体的仔猪,结果显示,接种HNX株的仔猪,出现体温升高,瘙痒等临床症状,其鼻拭子和肛拭子中持续排毒21d,第28d大脑、肺、扁桃体、脾、肝和肾等组织中都检测出低拷贝数的PRVDNA。而接种Ea株的仔猪,无明显临床症状,其鼻拭子和肛拭子中短暂排毒,第28d大脑、肺和扁桃体等组织中检测出低拷贝数的PRV DNA。结果表明,HNX株对PRV Bartha株母源抗体的仔猪有很强的致病力,母源抗体不能保护仔猪抵御PRV HNX株感染,也不能阻止其排毒。5.HNX株对Bartha株疫苗免疫仔猪的致病力研究免疫Bartha株弱毒疫苗28d的仔猪和未免疫疫苗的PRV抗体阴性仔猪分别都滴鼻感染和颈部肌肉注射107TCID50的HNX株,结果显示,所有仔猪感染HNX株后,都出现体温升高、食欲不振、打喷嚏、呼吸困难、精神沉郁等临床症状,其鼻拭子和肛拭子中持续排毒,第16d大脑、肺、扁桃体、脾和肝等组织中都有高拷贝数的PRV DNA,感染仔猪的大脑、扁桃体、肺、脾和肾等组织中都有严重的病变和病理损伤,免疫组化都出现阳性信号,其中扁桃体和肺组织中阳性信号最强;未免疫疫苗的阴性仔猪出现神经症状,50%的仔猪死亡。结果表明,PRV HNX株对抗体阴性仔猪和疫苗免疫的仔猪都有很强的致病力,Bartha株弱毒疫苗免疫,不能保护仔猪抵御HNX株的感染,不能阻止仔猪排毒,也不能阻止PRV HNX株在大脑、扁桃体、肺、脾和肾等组织中定植。6.HNX、HNB、Fa和Ea株全基因组测序研究利用第二代高通量测序技术和Sanger法分别对HNX、HNB、Fa株和Ea株进行全基因组测序,其核苷酸序列数分别为142294bp、142255bp、141930bp和142334bp,GC含量分别为73.56%、73.61%、73.67%和73.60%,Gen Bank登录号分别为KM189912、KM189914、KM189913和KU315430,都编码70个基因,均包含独特长序列区(UL),内部重复序列(IRS),独特短序列区(US)和末端重复序列(TRS)等4部分。7.PRV不同毒株比较基因组学研究对PRV HNX、HNB、Fa、Ea株与Bartha株等PRV毒株的全基因组和各基因序列比对分析,结果显示,HNX株与HNB、Ea、Fa和Bartha株的同源性分别为98.1%、96.7%、96.4%和90.1%,Ea和Fa株与Bartha株的全基因组序列同源性分别为90.3%和90.7%,HNX、HNB、Ea、Fa株与Bartha株的所有基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.1%-99.9%和82.3%-99.7%;HNX、HNB、Fa、Ea株与国外分离株全基因组比对,其UL36基因、US1基因和非编码区序列同源性较低,HNX和HNB株与Fa株各基因氨基酸比对,有26个基因出现了差异,其中UL49.5,UL36和US1基因氨基酸差异率最大;PRV全基因组进化树存在两个独立分支:中国分离株分支与国外分离株分支,中国分离株分支位于不同亚分支,中国新分离株与中国2012年前分离株的免疫原性基因分别位于两个亚分支,而毒力相关基因位于同一个亚分支。结果表明,中国分离株之间全基因组同源性比Bartha、Becker、Kaplan株高,亲缘关系较近,中国新分离株与2012年前中国分离株基因组免疫原性基因进化出不同的亚分支,而毒力相关基因进化关系未分化。8.PRV全基因组和部分基因序列重组分析研究对PRV HNX、HNB、Fa、Ea株和Bartha、Kaplan、Becker、TJ、ZJ01、He N1、JS-2012等株全基因组序列和部分基因进行重组分析,结果显示,PRV基因组在UL区、IR区、US区和TR区内未出现基因片段重组,UL51、UL49.5、UL49、UL47、UL46、UL27、UL36、UL44、UL15、UL1、IE180、US1、US8等差异较大基因也未出现重组现象。结果表明,中国新分离PRV不同株之间以及与Bartha株之间没有出现重组现象。