论文部分内容阅读
芦荟苷(Aloin,C21H22O9)是从芦荟中提取的天然蒽醌苷类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效;泰能（TIENAM）是一种广谱抗生素,适用于多种病原体引发的混合感染;乌司他丁（Urinastatin）是从健康男性尿液中分离出的非肽类蛋白酶抑制剂,用于胰腺炎、急性循环衰竭等病症;而脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征。本文通过构建CLP（盲肠结扎与穿刺）手术诱导小鼠的脓毒症模型和LPS诱导Raw 264.7细胞的炎症模型,研究芦荟苷是否具有治疗脓毒症的可能性。首先通过LPS诱导Raw 264.7细胞发现,100μg/m L Aloin可以显著性降低LPS诱导的炎症因子和炎症因子m RNA的表达量;再建立合格的小鼠脓毒症模型,从个体水平检测Aloin对脓毒症小鼠的保护作用,在CLP手术后给小鼠腹腔注射Aloin（10 mg/kg/d）、阳性对照药物Urinastatin（10~3U/kg/d）、抗生素TIENAM（50mg/kg/d）,发现单独给予脓毒症小鼠Aloin时,7天后存活率为40%;当Aloin与TIENAM联合作用时,7天后小鼠的存活率为60%。最后从脓毒症小鼠的各项分子指标检测小鼠血清和组织中的炎症因子表达量、炎症因子基因表达量、小鼠HE染色组织切片等发现Aloin与TIENAM联合作用时小鼠的分子指标最接近于未进行结扎穿刺的假手术（Sham）组。然后利用已获得的治疗脓毒症小鼠的Aloin（10 mg/kg）、Urinastatin（10~3U/kg）和TIENAM（50 mg/kg）的用药条件,在24 h后检测小鼠外周血中B细胞、T细胞、NK细胞等免疫细胞的表达量。在CLP手术24 h后发现,B细胞表达量、CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值、Treg细胞以及TNFR2+Treg细胞、NK细胞以及激活的NK细胞都显著性上调（P＜0.05）,当分别使用Aloin和Urinastatin、TIENAM单独治疗后,CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值显著性下调（P＜0.05）,而其他免疫细胞表达量也有下调的趋势;当Aloin与TIENAM联合治疗后B细胞、NK细胞、Treg细胞和TNFR2+Treg细胞的表达量都显著性下调（P＜0.05）。因此,在CLP手术24h后小鼠的免疫系统处于激活状态,使用Aloin、Urinastatin、TIENAM分别治疗后,有一定的免疫抑制作用,当Aloin与TIENAM联合治疗后免疫抑制效果最明显。其次利用转录组测序技术探究Aloin对CLP手术诱导的小鼠脓毒症的保护机制的转录组学规律,将clean reads与小鼠参考全基因组比对组装后,再分别与GO、KEGG、COG数据库进行比对。比较模型组和Aloin给药组之间的差异表达基因的注释情况,与Sham组水平相比,CLP手术24 h后有差异表达的基因数目为90个,其中上调45个,下调45个;与模型组相比,使用Aloin治疗后有差异表达的基因为253个,其上调55个,下调198个。对于“假手术组vs模型组”,注释到COG、GO、KEGG数据库的基因数目分别是22、68、76;对于“模型组vs Aloin治疗组”,注释到COG、GO、KEGG数据库基因数目分别是68、190、186。可见Aloin对于脓毒症小鼠的保护作用,是多个差异表达基因协同调节的结果,对差异表达基因KEGG通路分析得出,主要是Ribosome、Oxidative phosphorylation、Aizheimer’s disease、Parkinson’s disease等pathway相关,这为后续对于Aloin功能机制的研究工作奠定了基础。最后在CLP手术24 h后,收集小鼠的腹腔微生物,利用宏基因组技术检测脓毒症小鼠的腹腔微生物。与假手术组相比发现模型组的腹腔微生物发生了明显的变化,主要表现为Mucispirillum（穆齐螺旋菌属）、Escherichia（埃希菌属）等有害菌属的物种丰度增加,而Acinetobacter等有益菌减少,当使用Aloin治疗后能改善这种腹腔菌群紊乱。通过将Aloin对CLP手术诱导的脓毒症小鼠的保护作用与腹腔菌群相联系,这为进一步探究Aloin的抗炎机制奠定了基础。综上所述,Aloin可以提高CLP手术诱导的脓毒症小鼠的个体存活率,降低脓毒症小鼠体内炎症因子的表达量和脓毒症小鼠组织损伤,当Aloin与TIENAM联合治疗后对脓毒症小鼠的治疗作用最明显。通过对脓毒症小鼠转录组分析,对差异表达基因注释分析发现Aloin对脓毒症小鼠的治疗作用是多个差异表达基因协同调节的结果,对差异表达基因KEGG通路分析得出主要与Ribosome、Oxidative phosphorylation、Aizheimer’s disease、Parkinson’s disease等信号通路相关,这为后续对于Aloin功能机制的研究工作奠定了基础。通过对小鼠腹腔的菌群分析,可以对腹腔内的细菌进行多样性分析,进一步再针对由CLP手术诱导的脓毒症小鼠的治疗提供指导性意义。