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炎症反应与肿瘤的发生发展密不可分,炎症过程是肿瘤发生发展的诱因,当炎症反应不可控制发展成为慢性过程时,可以诱发周围组织恶性生长并形成肿瘤。免疫应答可以促发抗肿瘤的保护性反应,但同时也通过直接或间接作用参与肿瘤血管新生和肿瘤细胞生长、侵袭的转移。核转录因子NF-κB在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起关键作用,NF-κB的错误调节与慢性炎症以及多种恶性肿瘤的发生有关,同时NF-κB通路激活与促活相关。异甘草素(Isoliquiritigenin,ILG)是从中药甘草的根茎中提取出的一种黄酮类化合物,具有多种生物学效应和药理学活性。研究表明ILG可以抗炎、抗氧化应激,且能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移,并促进肿瘤细胞凋亡,但其作用机制以及是否对肺部炎症和肺部恶性肿瘤具有同样作用并不明确,此外NF-κB是否为ILG抗炎、抗肿瘤的效应通路仍有待于探索。研究目的:炎症与肿瘤发生发展的关系越来越受到关注,合并炎症反应的肺癌给临床治疗更加了难度。本研究旨在观察ILG是否能够双向调控肺部慢性炎症与肺恶性肿瘤,明确NF-κB以及PI3K/AKT和Nrf2/HO-1信号通路相关基因在其中的调控作用,阐明ILG通过NF-κB通路发挥抗炎与抗肿瘤双重作用。为肺部炎症和肺癌的临床治疗以及新药物研发提供科学依据。研究方法:一、异甘草素抗COPD炎症反应的作用COPD是是由于肺部异常炎症反应和氧化应激引起的常见慢性病,通过构建COPD模型阐明异甘草素的抗炎机制。通过自制烟雾暴露装置,给予C57BL/6小鼠每日烟雾暴露处理1小时,经过12周烟雾处理后构建COPD小鼠模型,分别给予10、20、30mg/kg ILG,采用HE染色法、小鼠肺湿/干比观察小鼠肺部炎症及水肿情况;通过测定小鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性及丙二醛(MDA)含量,计数小鼠支气管肺泡灌洗液中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,以及检测支气管肺泡灌洗液中炎性因子TNF-α和IL-1?,了解ILG对COPD模型小鼠的抗氧化应激和炎性反应的改善作用;采用Real time-PCR法和Western Blot法检测肺组织NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路相关基因的表达水平,明确NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路在ILG对COPD保护效应中的调控作用。二、异甘草素抑制肺癌的作用体外实验:使用RPMI 1640培养基培养A549细胞,给予不同剂量的ILG。采用MTT法测定A549细胞活力;利用流式细胞术检测细胞凋亡率,通过Real time-PCR和Western Blot法测定A549细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的表达变化;采用Transwell法测定A549细胞的迁移能力,采用Real time-PCR和Western Blot法检测A549细胞炎性和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9和COX-2的表达水平,明确ILG对A549细胞凋亡、迁移和炎性反应的影响。采用Western Blot法检测A549细胞NF-κB和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平,阐明NF-κB和PI3K/AKT信号通路在ILG抑制A549细胞中的调控作用。体内实验:利用BALB/c裸鼠构建A549移植瘤建模,随机分为空白对照组(NC),肿瘤模型组(TC),ILG低剂量组(ILG-L),ILG高剂量组(ILG-H),通过对肿瘤大小、体重及脏器系数的检测分析ILG对A549移植瘤小鼠的抑瘤作用;采用ELISA法检测荷瘤小鼠血清肿瘤标志物CEA、NSE、CA125、SCC水平;通过Real time-PCR和Western Blot法检测小鼠肿瘤组织凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8及Caspase 9 mRNA和蛋白表达水平,观察ILG对荷瘤小鼠移植瘤细胞凋亡的影响。采用Real time-PCR和Western Blot法测定小鼠肿瘤组织炎性和迁移相关基因MMP-2、MMP-9及COX-2mRNA和蛋白表达水平,明确ILG对荷瘤小鼠肿瘤细胞迁移和炎性反应的影响;采用Western Blot法检测NF-κB和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平,进一步验证NF-κB和PI3K/AKT信号通路在ILG抑制A549细胞中的调控作用。研究结果:一、异甘草素抗COPD炎症反应的作用1.构建吸烟引起COPD小鼠模型,给予不同组小鼠10、20、30mg/kg ILG,小鼠的肺湿/干比测量结果显示,COPD模型小鼠的肺水肿程度明显高于对照组小鼠(P<0.05),随着ILG剂量的小鼠肺部水肿明显改善(P<0.05)。小鼠肺部病理学结果显示吸烟可以诱发小鼠肺部COPD典型的炎性改变,并随着ILG剂量的增加,小鼠肺部炎性改变明显减轻。2.对小鼠肺部组织中MPO和MDA含量检测结果显示,吸烟可导致小鼠肺组织MPO和MDA含量显著增加,COPD模型小鼠肺组织MPO和MDA含量明显高于对照组(P<0.05),随着ILG剂量的增加MPO与MDA含量下降(P<0.05)。3.COPD小鼠BALF中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数显著增加(P<0.05),ILG的使用可减少小鼠BALF中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,且随着ILG剂量的增加细胞数下降明显(P<0.05)。COPD小鼠BALF中炎性因子TNF-α和IL-1?含量明显增加(P<0.05),ILG的使用可使两种炎性因子含量明显下降,且随着ILG使用浓度增加表达量逐步降低(P<0.05)。4.对炎性和氧化应激相关通路NF-κB相关基因表达检测结果显示,COPD小鼠肺组织p-p65,p-IκB被激活,表达明显高于对照组(P<0.05),而ILG能够显著抑制p-p65,p-IκB蛋白的表达,阻遏了NF-κB通路,且随着ILG剂量的增加,抑制作用增强(P<0.05)。5.Nrf2是抑制NF-κB的关键蛋白,COPD小鼠肺组织Nrf2和HO-1表达含量均明显增高,ILG的使用增加了Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),且随着ILG剂量的增加两种基因和蛋白的表达量显著增加(P<0.05)。ILG可能通过影响NF-κB与Nrf2/HO-1通路进而调控COPD小鼠的炎性反应和氧化应激反应,Nrf2/HO-1通路可能会协助增加ILG对NF-κB的阻遏效果。二、异甘草素抑制肺癌的作用1.体外实验(1)随着ILG浓度的增加及作用时间的延长,A549细胞存活率逐渐降低(P<0.05),在24h和48h,ILG对A549细胞的IC50分别为16.7μM和14.6μM。因此,后续实验采用药物浓度为4μM、8μM和16μM。(2)A549细胞经不同浓度ILG作用24 h后,随着ILG给药浓度的增加,A549细胞凋亡率显著增加(P<0.05);促凋亡基因Bax mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.05);Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活化程度逐渐增强,mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。(3)A549细胞经不同浓度ILG作用24 h后,随着ILG给药浓度的增加,A549细胞迁移能力显著降低(P<0.05);MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量均显著低于空白对照组(P<0.05),且随着给药剂量的增加,MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量逐渐降低。(4)A549细胞经8μM和16μM ILG作用24 h后,NF-κB信号通路和PI3K/AKT信号通路被抑制,且呈浓度依赖性。2.体内实验(1)不同浓度剂量的ILG药物治疗组小鼠肿瘤体积均小于TC组,且ILG高剂量组肿瘤体积显著小于低剂量组(P<0.05)。(2)与肿瘤模型组相比,Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的蛋白和mRNA表达水平在ILG给药组中均显著升高(P<0.05)。(3)ILG给药组MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量显著低于TC组(P<0.05),且高剂量ILG对MMP-2、MMP-9和COX-2表达的抑制效果更强。(4)较之与TC组,ILG的使用降低了小鼠肿瘤组织中的p-IκB及p-p65的表达,抑制了NF-κB通路的激活;同时随着ILG剂量的增多,抑制作用明显上升(P<0.05)。ILG的使用也降低了小鼠肿瘤组织中AKT和PI3K的磷酸化水平,且具有浓度依赖性(P<0.05)。(5)TC组相较于NC组小鼠血清肿瘤标志物NSE和CA125显著上升(P<0.05),而不同剂量ILG给药后,血清NSE和CA125水平较TC组明显下降(P<0.05)。结论:1.异甘草素可能通过调节NF-κB和Nrf2/HO-1在COPD小鼠肺部炎症模型中起到抗炎作用。2.异甘草素可能通过NF-κB和PI3K/AKT通路发挥抗肿瘤效应。3.异甘草素作用靶标可能是NF-κB相关分子,其可能发挥抗炎、抑制肿瘤细胞存活的双重作用。虽然初步发现下游机制有所不同,但是具体机制还需要进一步研究。综上实验结果,进一步支持作为中药提取物的异甘草素可能作为一种抗肿瘤药物或辅助药物的可能。