糖脂代谢失调性疾病是指因体内糖脂代谢异常而造成全身脏器损伤及功能减退的一类疾病,其主要临床症状表现为高血糖、高血脂、肝脂蓄积以及胰岛素抵抗等。目前糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等糖脂代谢失调性疾病发病率不断上升,已成为人民健康的严重威胁。然而由于它们的发病机制至今尚不明确,造成这类疾病缺乏有效的治疗药物。microRNA作为体内众多生理过程的重要调控分子,在糖脂代谢失调性疾病发生发展中的作用逐渐被发现,为这类疾病发病机制研究和药物研发提供了新的可能。我们针对实验室前期研究发现的对CYP2E1表达具有双重调控机制的miR-552-3p进行深入序列分析发现其序列中具有与NR1家族核受体响应元件类似的碱基排列;同时基于NR1家族核受体对糖脂代谢的关键调控作用,提出本论文拟解决的科学问题—miR-552-3p与糖脂代谢的关系及其在糖脂代谢失调性疾病中的功能。miR-552-3p的生物学功能目前多集中在肿瘤领域,其对糖脂代谢的调节作用尚未有人涉及。基于此,我们通过体内和体外实验对miR-552-3p对糖脂代谢调节的功能及作用机制进行了深入和系统的研究。miR-552-3p调控代谢相关基因表达的功能发现:利用RNA-seq技术和KEGG分析,我们发现在细胞内miR-552-3p所调控的基因,特别是受到miR-552-3p影响表达下调的基因与代谢信号通路密切相关。同时在转染miR-552-3p抑制剂减少细胞内miR-552-3p的含量后检测细胞内代谢相关基因表达的水平,发现内源miR-552-3p同样具有调控代谢相关基因表达的能力。miR-552-3p改善糖脂代谢异常的功能发现:我们构建了糖脂代谢紊乱的小鼠模型(高糖高脂饮食28周)以及同周龄的对照小鼠(正常饮食28周),利用具有肝脏特异性的腺相关病毒系统在小鼠肝脏内过表达miR-552-3p,对其体内调控糖脂代谢的生物学功能进行了研究。随后我们在8周龄db/db小鼠体内对其调控糖代谢的能力进行了重复确证。(1)在血脂异常方面,我们发现miR-552-3p对高糖高脂饮食引起的低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇以及甘油三酯含量的升高具有抑制作用,但对高密度脂蛋白胆固醇含量的升高没有影响。而对正常饮食小鼠中相关指标进行检测显示miR-552-3p过表达会引起正常饮食小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇的轻微升高,对其他血脂指标没有影响。口服脂耐量实验显示miR-552-3p具有促进高糖高脂诱导小鼠以及正常饮食小鼠血脂代谢,改善脂耐量的作用。(2)在肝脂异常方面,通过对肝脏切片进行H&E以及油红染色,我们发现miR-552-3p过表达后可以显著减少小鼠肝脏内由于脂质蓄积导致的空泡以及油红的着色,表明miR-552-3p可以抑制高糖高脂饮食引起的肝脂蓄积。利用试剂盒对肝脏内脂质含量检测的结果同样证明了这一结论。并且我们在小鼠肝原代细胞内进行实验也表明miR-552-3p可以抑制肝原代细胞内由于脂肪酸刺激诱导的脂质增多。(3)在糖代谢紊乱方面,我们发现miR-552-3p除了可以抑制由于高糖高脂饮食导致的血糖升高,还可以减缓db/db小鼠血糖随时间而增长的趋势。口服葡萄糖耐量实验表明miR-552-3p可以改善2种模型小鼠的糖耐量。进一步通过胰岛素抵抗指数、胰岛素耐量实验以及体内胰岛素通路的检测,我们发现miR-552-3p可以缓解胰岛素抵抗,增加小鼠肝脏对胰岛素的响应水平。而进一步体内丙酮酸耐量实验以及体外糖输出实验共同表明miR-552-3p可以抑制肝糖异生。(4)最后我们还探究了miR-552-3p对小鼠整体代谢速率的影响。通过代谢笼实验对小鼠的氧耗速率,能力消耗率以及活动能力进行检测,实验结果显示miR-552-3p过表达可以增加糖脂代谢紊乱小鼠的代谢速率,促进小鼠自主活动。综上所述,miR-552-3p对多种不同诱因导致的糖脂代谢紊乱小鼠模型的糖脂代谢均具有改善功能。miR-552-3p调控FXR以及LXRα转录活性的发现:实验室前期成果表明miR-552-3p在细胞质以及细胞核内均具有调控基因表达的功能,并且鉴于NR1家族核受体在核内发挥转录调控的功能,我们推测miR-552-3p可能在核内发挥调控代谢相关基因表达的功能。首先我们利用siRNA对细胞内负责转运microRNA入核的蛋白Importin8进行敲低,以探究miR-552-3p发挥功能的细胞定位,结果显示大部分基因受到miR-552-3p在细胞核内的调控。进一步通过对RNA-seq以及蛋白质谱结果中差异基因进行IPA分析来找寻miR-552-3p调控的下游信号通路,我们发现受到miR-552-3p调控的基因主要富基在FXR/RXR以及LXR/RXR两条信号通路中,表明miR-552-3p可能通过调控FXR以及LXRα影响下游基因表达。随后,在核受体转录激活实验中,我们证明miR-552-3p可以浓度依赖的抑制LXRα转录活性,激活FXR转录活性,且FXR拮抗剂Stigmasterol以及LXR激动剂GW3965可回复miR-552-3p调控FXR、LXRα转录活性以及下游代谢相关的FASN、SCD、ApoB等基因表达的功能,这证明了miR-552-3p是通过对FXR和LXRα的调控来发挥功能。miR-552-3p调控FXR以及LXRα转录活性的作用机制:根据miR-552-3p可以与DNA相结合的特性,我们首先检测了miR-552-3p与FXR以及LXRα响应元件(IR1,DR4)的结合能力。通过DNA Pull Down实验以及荧光共振能量转移实验,我们证明了miR-552-3p可以与LXRα响应元件DR4的反义序列以及FXR响应元件IR1的正、反义序列相结合。进一步根据序列分析将miR-552-3p进行突变并用突变体进行实验,结果显示miR-552-3p中与FXR以及LXRα响应元件核心序列AGGTCA类似的碱基序列对其调控FXR以及LXRα转录活性至关重要。接着利用EMSA实验以及ChIP实验,我们证明了miR-552-3p与转录因子响应元件的结合可以影响转录因子与其响应元件的结合及下游基因的转录起始。此外通过对小鼠肝脏内基因表达的检测以及在体ChIP实验证明体内过表达miR-552-3p同样在转录水平对代谢相关基因的表达进行调控。进一步利用FXR拮抗剂Stigmasterol以及LXR激动剂GW3965证明了miR-552-3p通过调控FXR以及LXRα转录活性起到改善糖脂代谢异常的功能。综上所述,本论文通过体内和体外实验阐明了miR-552-3p通过与糖脂代谢关键转录因子的响应元件结合影响其转录活性,进而调控下游基因的表达,发挥改善糖脂代谢异常的生物学功能。本论文首次在多种动物模型中研究了miR-552-3p改善糖脂代谢紊乱的生物学功能,提出了microRNA可通过调控转录因子转录活性从而影响基因表达的新机制,揭示了microRNA与转录因子之间的新关联。这些新发现为进一步研究microRNA调控下游基因表达提供了新机制,为microRNA参与体内糖脂代谢提供了新依据,为糖脂代谢失调性疾病的药物研发提供了新方向。