肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是一种人类常见致病菌,可引起成人、儿童的社区获得性呼吸系统感染。除呼吸系统疾病,25%感染MP的患者还经历多种严重的肺外并发症,如脑炎、多神经根炎。近年有研究发现MP感染还和哮喘的发病密切相关。虽然近年大量研究从基因和蛋白结构功能两方面深入探讨了MP致病机制,主要倾向于呼吸道上皮细胞黏附、细胞毒性、免疫学发病机制和MP直接侵入学说,但其确切的分子致病机制仍未阐明。随着“脂类组学”的出现,即采用质谱技术对脂类组的所有成分进行一次性的定性鉴定,许多与调控炎症因子相关的脂类分子相继被发现,这些发现使得从脂类的水平阐述微生物致病机制成为可能。在这些脂类分子中,鞘脂类尤其受到重视。除组成真核细胞结构外,鞘脂类(sphingolipids)和它的代谢产物还参与细胞生长,分化,凋亡和炎症反应的调控,并且在微生物感染中发挥重要作用。比如宿主能通过富集神经酰胺的脂筏抵御微生物的感染,另一方面,一些致病微生物则能利用宿主的鞘脂类来增强自身的毒力和侵袭性。MP是目前已知能在无生命培养基上生长繁殖的最小原核生物,因其基因结构简单,它丧失了编码细胞壁与合成生命活动所需成分的能力,因此它依赖从外界环境中摄取相关物质来维持生命活动。MP膜表面只含有少量鞘脂类,但它能利用外源性的鞘脂类(从外界环境中摄取,比如宿主细胞)加工合成自身的糖鞘脂。在有MP前驱感染的Guillain-Barre或Fisher综合症患者血清中可检测到抗神经节苷脂(糖鞘脂的一种)的自身抗体,这提示MP的糖鞘脂和宿主的分子结构相似。但到目前为止,尚未有对MP表面鞘脂类组成成分的系统研究,也未有对MP感染后宿主细胞鞘脂类代谢改变的研究。因此本研究应用脂类组学方法首先分析MP与A549细胞鞘脂类组成成分,而后又研究了MP感染对人肺癌上皮细胞(A549)鞘脂类代谢的影响。结果MP和A549的鞘脂类组成成分的质谱分析本研究应用MALDI-TOF MS首次鉴定了MP与A549细胞的鞘脂类组成,并比较两者鞘脂类成分,发现两者的绝大多鞘脂类成分相同,但质荷比(m/z)在507.8,511.1,549.7,574.5,729.6,751.5,833.3对应的鞘脂类却是MP特有的。因此我们把这7个鞘脂类的m/z作为MP的特异性标志。另一方面,m/z为508.9和518.8对应的鞘脂类却是A549细胞独有的。MP感染引起A549细胞鞘脂类成分改变本研究分别以1 CFU/cell,10CFU/cell和100CFU/cell浓度的MP感染A549细胞,2,12,24小时后分别从MP处理和未经处理的A549细胞中提取鞘脂类做MALDI-TOF MS分析。MP的感染显著改变了细胞神经酰胺和鞘磷脂的组成成分。比如2小时后1 CFU/cell浓度MP感染造成细胞某些种类的神经酰胺和鞘磷脂相对浓度发生了改变,12和24小时后,则有新种类神经酰胺的出现。10CFU/cell比1CFU/cell浓度MP感染作用强,在2小时后就有新种类神经酰胺出现。而100CFU/cell浓度MP感染作用在24小时后表现最明显,产生多种新种类神经酰胺和鞘磷脂。因此MP干扰细胞鞘脂类代谢有时间和剂量的依赖性。MP感染影响SPT在A549细胞上的表达MP感染显著影响了细胞鞘脂类组成成分,因此本研究用RT-PCR检测了鞘脂类代谢通路上的两种关键酶ASM,SPT的mRNA水平。SPT是神经酰胺从头合成途径的限速酶,而ASM则是水解鞘磷酯合成神经酰胺的限速酶。结果显示SPTmRNA在感染24小时后显著下降,而在其它处理条件下ASM和SPT mRNA没有发生变化。MP感染诱导ASM在细胞表面脂筏上的聚簇本研究应用免疫荧光的方法观察不同感染浓度、时间下ASM在细胞膜表面脂筏上的分布。结果表明2,24小时MP感染不能诱导ASM聚簇,而在12小时,浓度为1CFU/cell,10CFU/cell的MP能诱导ASM在脂筏上聚簇,而100CFU/cell则不能。结论:1.运用脂类组学方法我们首次鉴定了MP鞘脂类的组成为今后更深入研究MP表面自身免疫相关的糖脂类奠定了基础。2.MP感染能诱导宿主细胞生成新的神经酰胺及ASM聚簇,这种鞘脂类代谢变化可能和宿主细胞抵抗微生物产生的免疫炎症反应有关。