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目的:生发基质-脑室内出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricular hemorrhage,GM-IVH)是早产儿颅内出血最常见的类型。在过去的几十年中,随着医疗技术水平及护理水平的提高,早产儿的存活率显著增加,但对于孕周小,出生体重低的早产儿而言,GM-IVH的发病率仍是一个主要问题。GM-IVH可留有不同程度的神经系统后遗症,如癫痫、认知异常、脑瘫等,因此GM-IVH及其导致的神经系统后遗症仍然是全球范围内的重大公共卫生问题。当前对于GM-IVH后继发性脑损伤机制还不是十分清楚。早产儿发生GM-IVH后常常合并侧脑室扩张,除对症治疗外,目前尚无有效的治疗手段,腰椎穿刺是主要的对症治疗方法之一,目的是释放出聚积在侧脑室内和脑脊液中的陈旧出血、增高的蛋白质以及过多的脑脊液,保持脑脊液循环通路的畅通,防止侧脑室持续扩张,形成严重的脑积水,减轻对脑组织的压迫。通过腰椎穿刺方法,对引流出的脑脊液进行动态检测发现了一个十分突出的现象,这类早产儿脑脊液糖的含量持续低于正常早产儿参考值,但患儿血糖正常,Volpe总结如下:这种无法用炎症解释的脑脊液糖浓度的降低发生于出血后第1天,5-15天最明显,常常持续数周,最长持续至出血后3个月。大脑的能量来源主要依赖于葡萄糖,而葡萄糖从血液进入脑细胞必须通过葡萄糖转运蛋白1(glucose transport1,GLUT1)和葡萄糖转运蛋白3(glucose transport3,GLUT3)的介导。在先天性GLUT1缺乏症的患儿中,脑脊液中糖含量低于正常值,而同一时间的血液中的糖浓度是正常的,脑脊液/血葡萄糖之比降低,乳酸的含量正常或降低,CT、MRI脑部影像学正常,EEG表现为背景波较慢,多有弥漫性或局灶性的异常放电,患儿常表现为抗癫痫药物治疗无效的癫痫发作,发育迟缓,获得性小头畸形,共济失调、智力低下等。目前对GM-IVH患儿脑脊液糖浓度降低的机制不清楚,是否参与了继发性脑损伤也不清楚?最初认为脑脊液糖浓度降低是由于红细胞的消耗和无氧糖酵解的增加,但随后均因为脑脊液红细胞清除后和乳酸浓度正常,糖浓度依然持续在低水平而被否决,有学者猜测可能因为出血破坏了脑内葡萄糖的转运导致了脑脊液持续的糖浓度降低。查阅文献未见相关的报道。本实验通过GM-IVH动物模型,应用蛋白印迹实验方法,定量分析了脑室周围脑组织GLUT1、GLUT3蛋白的表达,探讨GM-IVH后脑脊液糖浓度降低的可能机制,为临床提供新的治疗手段开辟思路。方法:1将怀孕29天的新西兰孕兔进行剖宫产,迅速将幼兔取出,并给予保温、奶粉喂养。将幼兔随机分为两组,在生后3小时之内,其中一组的早产兔给予50%的丙三醇,剂量按10ml/Kg,经腹腔注射,另一组的早产兔不给予任何处理。2两组早产兔分别于生后24小时接受头颅超声检查,观察GM-IVH发生情况。选取接受丙三醇注射后发生GM-IVH的早产兔15只,为模型组,未给予任何处理的未发生GM-IVH的早产兔15只,为对照组,然后将两组分别随机分为生后24h、48h、72h三个亚组,按上述时间点给予麻醉,由内向外迅速选取脑室周边区域组织,一部分新鲜脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定,供后期苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),以观察早产兔发生重度GM-IVH后,脑组织细胞形态的变化,另一部分新鲜脑组织立即用液氮冷冻,然后将标本放到-80℃冰箱,供蛋白印迹实验用,用蛋白印迹法检测对照组与模型组早产兔脑组织的GLUT1蛋白和GLUT3蛋白的表达。3统计方法:采用SPSS13.0统计学软件、Microsoft Excel 2003进行数据处理。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示,均数比较前先行方差齐性检验,不同时间点多个样本均数的比较采用LSD法(Least-significant Difference)检验,两个样本均数的比较采用独立样本t检验(Independent Samples Test),若不满足方差齐性检验则采用秩和检验(rank-sum test)的方法。检验水准定为0.05,P值小于0.05有统计学意义。结果:1成功的建立了早产兔Ⅲ度GM-IVH模型通过头颅超声、大体标本观察、脑组织HE染色观察证实早产兔GM-IVH模型的成功制备。2脑组织GLUT1蛋白的表达用蛋白印迹实验方法检测早产兔脑组织GLUT1的表达,对照组脑组织标本中GLUT1表达量在生后24h、48h、72h是逐渐减少的,三个时间点间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组早产兔脑组织标本中GLUT1表达量在生后24h、48h、72h三个时间点间两两比较亦有差异(P<0.05),以生后24h最高,其次是生后48h,最后是生后72h;模型组早产兔脑组织标本中GLUT1蛋白量在生后72h低于同一时间点的对照组,而生后24小时、48小时的蛋白量均高于同一时间点的对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3脑组织GLUT3蛋白的表达用蛋白印迹实验方法检测早产兔脑组织GLUT3表达,对照组脑组织标本中GLUT3表达量在生后24h、48h、72h是逐渐增多的,三个时间点间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组早产兔脑组织标本中GLUT3表达量在生后24h、48h、72h三个时间点间两两比较亦有差异(P<0.05),以生后48h最高,其次是生后24h,最后是生后72h,模型组早产兔脑组织标本中GLUT3蛋白量在生后24h与对照验组同一时间点相比较,差异无统计学意义(P>0.05),72h的蛋白量低于同一时间点的对照组,而48小时的蛋白量高于同一时间点的对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1正常早产兔在生后72小时内随着生后日龄的增长,脑部GLUT1蛋白量是减少的,而GLUT3蛋白量是增多的。2早产兔发生重度GM-IVH后,脑组织GLUT1表达量的上调,代表一种代偿反应,之后的降低导致了脑脊液糖浓度的降低。3早产兔发生重度GM-IVH后,脑组织GLUT3蛋白量有暂时性的增多,是脑部的一种保护反应,之后的减少提示参与了重度GM-IVH后继发性脑损伤。