背景/目的:癌症始终是威胁人类健康的第一大杀手。肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,临床上会采用手术切除、肝移植和放化疗等手段进行治疗,但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低,中国每年死于肝癌人数约11万人,占全世界死亡人数的45%。乳腺癌是女性最常见的癌症之一,尽管科技医疗水平与日俱增,全球女性的患病风险仍居高不下。据统计,全世界每年死于乳腺癌的女性患者约有40万例。因此要做到癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗。虫草素(cordycepin),别名虫草菌素、蛹虫草菌素等,是冬虫夏草中主要的活性成分,一种内源性核苷,具备了抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗菌、免疫调节、清除氧自由基等多种药理作用。虽然虫草素显示出良好的临床应用前景,但不难发现药物到达病灶后存在吸收率低,溶解度差,直接给药作用效果不佳等缺点,本研究的目的就在于开发有效的靶向脂质体载药系统以提高虫草素的溶解度和生物活性,并对该载药系统进行体内外的各项指标评价。本研究主要包括以下几个方面:1、虫草素抗肝癌和抗乳腺癌活性评价癌细胞凋亡一直以来受到人们广泛关注,有研究表明线粒体是凋亡的核心部位,可作为癌症治疗的有效靶点,当线粒体膜电位下降会进而启动Caspase依赖的细胞凋亡过程MAPKs及AKT信号通路通过调控m TOR蛋白活性而抑制肿瘤生长。通过以肝癌细胞Hep G2和PLC/PRF/5以及乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为细胞模型,分别对其进行细胞活力,细胞增殖,LDH活性,活性氧水平,线粒体膜电位变化及凋亡相关蛋白含量分析等一系列体外实验测定,同时在裸鼠中进行体内实验,使用剂量为30mg/kg的虫草素进行为期两周的药物治疗。结果发现虫草素可以诱导肝癌细胞和乳腺癌细胞的凋亡,促进癌细胞内ROS的积累,导致线粒体相关凋亡蛋白含量发生变化,并且给药后裸鼠肿瘤体积明显降低。因此,体内外实验均证实了虫草素的抗癌效果,确定了虫草素的药用安全性。2、虫草素脂质体的制备及表征初步体内代谢脂质体是一种具有良好生物相容性的有效载体,常用于靶向输送药物,提高治疗效果,并降低敏感器官的毒副作用。通过体外分析虫草素脂质体中虫草素的HPLC方法,建立了虫草素的标准曲线,在0.1-200ug/ml的范围内线性良好,R2达到1,包封率为65.3%。方法学考察后发现其精密度、稳定性均较好。为了增加其实际应用价值,我们又建立了一个聚乙二醇脂质中间层和靶向配体外层的多层脂质纳米粒,主要通过转铁蛋白修饰的脂质体并且包载含有虫草素新型载药系统,并对虫草素、脂质体、转铁蛋白修饰的脂质体进行粒径和电位的检测。结果显示,转铁蛋白修饰的脂质体粒径为125nm,较脂质体91nm的粒径略大,转铁蛋白修饰的脂质体电位为2.9m V,比脂质体的9.2m V小,有显著性差异。又通过对脂质体、转铁蛋白脂质体进行了体外指标检测,均显示出脂质体和转铁蛋白脂质体都有较好的释放速度,转铁蛋白脂质体比脂质体的细胞毒性更强,摄取度高,诱导细胞凋亡能力更显著。3、虫草素脂质体及转铁蛋白脂质体抗肝癌和乳腺癌活性评价利用肝癌细胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)分别探究了LPs和Tf-LPs两种不同给药系统的体内、体外抗肿瘤作用及其相关机制。采用细胞抑制试验、ROS水平测定、线粒体膜电位检测、western blot、细胞摄取途径等对LPs和Tf-LPs载药系统进行了抗肿瘤活性分析,并通过小鼠肝癌模型和乳腺癌模型进行体内抗肿瘤作用的考察。体外评价结果表明,肝癌细胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)经Tf-LPs-虫草素组药物作用后其IC50值明显低于其他给药组,并且通过流式细胞术检测Tf-LPs-虫草素组的转染效率也明显优于LPs-虫草素组。抑制剂的加入是为了更好的对药物摄取途径进行探究,验证后发现它是以转铁蛋白介导的内吞途径进入肿瘤细胞并发挥作用。由于细胞内活性氧的积累会使线粒体膜电位发生改变,并引起细胞凋亡。Tf-LPs显著增加了细胞内ROS的产生并诱导线粒体膜电位去极化。western blot检测发现经Tf-LPs药物作用后促凋亡蛋白上升趋势显著,抗凋亡蛋白含量减少。这表明Tf-LPs-虫草素可以抑制两种肿瘤细胞系的细胞增殖,而且通过与ROS相关的线粒体途径诱导癌细胞的凋亡。体内评价结果表明,Hep G2和PLC/PRF/5肝癌异位模型和MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌异位模型经过14天药物治疗后,裸鼠体重变化不明显,而Tf-LPs-虫草素组肿瘤体积显著下降,说明Tf-LPs能运载更多的药物进去细胞发挥抗肿瘤作用。因此,在对脂质体的制备工艺和方法进行稳定性和安全性等考察后,又研究其在体内外的抗肿瘤活性,结果表明虫草素包被上转铁蛋白修饰的脂质体靶向制剂具有更好的抗肿瘤效果,为成为癌症靶向治疗的新型制剂提供理论依据。