玛咖蛋白肽的制备、鉴定及免疫调节活性的研究

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玛咖(Lepidium meyenii Walp.)是一种原产于秘鲁的十字花科植物。近年来,玛咖的免疫调节功能受到了广泛的关注,研究指出该功能与其中的多糖与生物碱相关。玛咖富含蛋白质(9.56%~21.90%),而蛋白质经酶解可产生多种生物活性肽。然而,目前较少有研究针对玛咖的蛋白质资源进行开发利用,更尚未有研究报道玛咖蛋白在玛咖免疫调节活性中的作用。因此,本文以玛咖蛋白为原料,一方面探究玛咖蛋白及其经胃肠消化后产物的免疫调节活性,并对其中的免疫活性肽进行鉴定与构效分析;另一方面探究预酶解的加工处理方式对玛咖蛋白经胃肠消化后免疫调节活性的影响。主要内容如下:(1)经TNBS法、福林酚法等测定,玛咖蛋白MCP经体外模拟胃肠消化所得产物MCPH的得率为28.00%,水解度为22.91%,可溶性肽得率为17.20%。玛咖蛋白MCP及其消化产物MCPH皆能使小鼠巨噬细胞RAW 264.7吞噬能力及表达NO、IL-6及TNF-α能力显著增强,且后者的免疫调节活性更高。MCPH中经Sephadex G-15凝胶层析分离的组分MCPH-1具有更高的活性,经鉴定其中共有45个与已知玛咖蛋白相匹配的肽段。(2)从MCPH-1得到的45个肽段皆具有免疫调节活性,其中肽段RNPFLP的活性最高。分子对接、受体抗体封闭及si RNA干扰结果表明,TLR2和TLR4是该肽段所识别的主要受体;通路抑制结果表明NF-κB及MAPK通路为该肽段所激活的主要信号通路;受体封闭对免疫信号通路相关蛋白表达影响的实验表明,该肽段能够通过识别以上两个受体来激活信号通路NF-κB及MAPK。HOMO分析及甲基化遮蔽结果说明,N端精氨酸的N9-H60是肽段RNPFLP的主要活性位点。(3)经中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及复合蛋白酶进行预酶解后,玛咖蛋白MCP的水解度、可溶性肽含量和游离氨基酸含量分别提高了35%、5%~16%及37%~92%,且经预酶解处理所得的胃肠消化产物的免疫调节活性没有显著性降低,说明预酶解能够在不影响其免疫调节活性的前提下显著增强玛咖蛋白的可消化性。其中,经菠萝蛋白酶预酶解得到的消化产物B4的免疫调节活性最高;对其中经Peptide Ranker活性评估、HPEPDOCK分子对接后排名前十的肽段进行评价,发现No.1肽NPYPFFGFSI和No.4肽SVPWVARF的免疫调节活性最高,而酪氨酸的C28、色氨酸的C35分别为该两者最有可能的活性位点。本研究表明,玛咖蛋白经模拟胃肠消化后能产生免疫调节肽,这意味着蛋白质可能在玛咖的免疫调节活性中起到一定的作用;而预酶解能够提高玛咖蛋白的可消化性,且不影响其经胃肠消化后的免疫调节活性。以上发现为玛咖的深加工提供了新思路,为玛咖资源的利用提供了新方向。
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