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研究背景及目的:由于血管阻塞和血流灌注不足引起的缺血性中风约占总中风病例的87%。大脑缺血后导致组织损伤甚至梗死,引起神经功能异常及行动意识减退等一系列级联反应。缺血性中风导致的机体损伤引发了细胞代谢紊乱和部分细胞器更新停滞,使得胞内自噬活动的长期动态平衡被打破。文献调查发现,自噬介导的神经元存活与Sirtuins家族(新陈代谢和寿命的主要调节剂)的调控有关,而Sirtuin 1(SIRT1)是其中最具特征的成员之一。补阳还五汤(Buyang huanwu decoction,BHD)作为临床常用的益气活血代表方,多用于治疗缺血性中风及其后遗症。已有证据表明,补阳还五汤含药血清可以上调SIRT1表达。该复方的疗效在临床上已得到广泛认证,而相关的实验研究对其在神经修复过程中的作用机制仍未阐明。因此我们提出假说:有效剂量的补阳还五汤干预为机体的行为恢复和神经恢复提供了可能,同时,在缺血性中风损伤及治疗的进程中可能有SIRT1/自噬通路的参与。本实验选用缺血性中风的实验动物模型,从整体水平和分子水平出发进行机制的探究与验证。研究内容及方法:1.补阳还五汤抗大鼠缺血再灌注损伤的脑保护作用大脑中动脉缺血再灌注(MCAO-R)作为实验模型;将雄性SD大鼠随机均分为五组:假手术组(SHAM)、大脑中动脉闭塞再灌注组(MCAO-R)、补阳还五汤低剂量组(BHD5 g/kg)、补阳还五汤中剂量组(BHD10 g/kg)、补阳还五汤高剂量组(BHD20 g/kg);通过NSS量表、TTC染色、大脑冰冻切片HE染色和尼氏染色分别检测神经功能缺损评分,大脑梗死体积,脑组织细胞形态的变化以及神经细胞尼氏体存活情况。2.补阳还五汤治疗缺血性中风的促神经再生作用及自噬在其中的作用机制MCAO-R作为实验模型;将雄性SD大鼠随机均分为四组:假手术组(SHAM)、大脑中动脉闭塞再灌注组(MCAO-R)、补阳还五汤组(BHD)、雷帕霉素组(Rapa);通过蛋白免疫印迹检测SIRT1,自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1的蛋白表达水平;通过免疫荧光单标记、免疫荧光双标记分别检测脑源性神经营养因子BDNF、未成熟神经元标记物DCX、神经干细胞标记物Nestin与自噬标记物LC3的蛋白表达情况。结果:1.补阳还五汤抗大鼠缺血再灌注损伤的脑保护作用:NSS评分结果显示,SHAM组大鼠的NSS评分(0.00±0.00)甚微,行为与感知力评价各方面正常,MCAO-R组大鼠评分(8.33±1.40)与SHAM组相比明显升高(P<0.01);术后低剂量和中剂量BHD5 g/kg,BHD10 g/kg组大鼠评分(7.42±1.24、4.63±0.91)与MCAO-R组大鼠比较略有下降(P<0.05,P<0.01);术后高剂量BHD20 g/kg组大鼠评分(2.42±0.79)与MCAO-R组大鼠比较降低(P<0.01)。TTC染色结果显示,SHAM组整个脑组织(0.00±0.00)切面全部染红,而MCAO-R组大鼠的脑组织(29.68±0.61)在手术缺血侧呈部分白色,显示皮层梗死,甚至梗死已延伸至整个半脑;补阳还五汤的中剂量和高剂量,即BHD10 g/kg、BHD20 g/kg组大鼠(13.29±0.57、6.92±0.45)与MCAO-R组相比梗死体积明显减少(P<0.01,P<0.01)。HE染色结果表明,MCAO-R组细胞内出现大量空泡,且细胞核难以着色,提示脑组织细胞出现损伤。术后20 g/kg剂量的BHD组细胞内出现空泡,胞核呈蓝色。而尼氏染色结果显示,SHAM组神经细胞的尼氏体大而密集,呈块状。MCAO-R组出现胞质体消失,胞体肿胀,核凝结。术后20g/kg剂量的BHD组尼氏体形态与着色情况较MCAO-R组有明显好转。2.补阳还五汤治疗缺血性中风的促神经再生作用及自噬在其中的作用机制:WB结果显示,与SHAM组相比,MCAO-R组大鼠脑组织自噬指标LC3-Ⅱ、Beclin-1表达升高(P<0.05),P62表达下调(P<0.01),这提示本实验在大鼠缺血再灌注损伤5天时,其大脑组织细胞的自噬处于激活状态。与MCAO-R组相比,BHD处理后自噬状态显著升高。自噬激动剂Rapa处理组与BHD组呈现出一致的趋势。与SHAM组相比,大鼠缺血再灌注损伤5天时MCAO-R组的SIRT1表达升高(P<0.05);与MCAO-R组相比,BHD组和自噬激动剂Rapa组的SIRT1表达明显升高(P<0.01)。大脑切片的免疫染色实验着重于补阳还五汤对缺血再灌注损伤的中枢神经系统影响。神经干细胞可以向神经元分化。BDNF和DCX的荧光标记结果印证了大鼠脑缺血再灌注损伤后给药补阳还五汤后,对神经元的保护及新生起到促进作用。同时神经干细胞标记物Nestin阳性细胞数在给药补阳还五汤后增加。结论:1.缺血再灌注损伤后机体细胞受损甚至死亡,尤其是神经细胞。该过程会启动自救程序,即细胞自噬;2.补阳还五汤可能促进神经再生发挥大鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用;3.脑缺血再灌注损伤后,补阳还五汤发挥作用可能与SIRT1/自噬通路的参与有关。综上,本实验中,缺血再灌注损伤后给予补阳还五汤干预,可能通过SIRT1/自噬通路发挥效用,此为过程;可能通过促进神经再生达到损伤后恢复,此为结果。