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骨矿化是一个复杂的过程,该过程受多种抑制因子和促进因子的调节,其中包括许多骨矿化相关蛋白。PRELP(Proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)是粘多糖与骨胶原的连接蛋白,分子量大小58kd,属于SLRR亚家族成员。PRELP含有富含精氨酸和脯氨酸的蛋白结构域,它的N端结构域可以结合基底膜聚糖上的肝素和硫酸乙酰肝素,通过其亮氨酸重复结构将I型胶原蛋白与基底膜聚糖相连。PRELP首次在关节软骨中发现,在软骨细胞、基底膜和生长中的骨细胞中高表达。最近研究结果表明,PRELP作为NF-k B抑制因子抑制破骨细胞生成,但是对成骨细胞矿化的作用和机制至今未见报道。目的:本研究旨在探究PRELP对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响,并对其作用机制作进一步的探索,为骨矿化相关机制的研究和骨矿化异常相关疾病治疗提供一种新的思路。方法:(1)本研究拟采用小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞建立一个体外矿化的细胞模型。MC3T3-E1细胞在成骨矿化诱导液(含有MK430)中培养21天,然后采用茜素红染色、实时荧光定量PCR和western-blot检测的方法对矿化指标进行检测。(2)为检测MC3T3-E1细胞成骨分化过程PRELP表达变化,将MC3T3-E1细胞在成骨分化诱导液中培养,实时荧光定量PCR、western-blot检测PRELP表达。(3)为检测PRELP对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响,拟采用RNA干扰技术下调PRELP表达,实时荧光定量PCR和western-blot验证干扰效果。(4)对成骨分化的影响,拟采用实时荧光定量PCR的方法检测成骨标志性基因(Runx2)的表达。对于成骨活性的检测,拟采用碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒检测ALP的活性,茜素红染色观察矿化结节的形成。(5)基因芯片用于检测PRELP下调表达后MC3T3-E1细胞基因表达谱变化,生物信息学分析PRELP作用的信号通路。(6)为验证PRELP下调表达对β-catenin信号通路的影响,拟采用western-blot检测β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的表达,免疫荧光技术检测β-catenin蛋白核转移,实时荧光定量PCR的方法和western-blot方法检测下游靶基因connexin43的表达。结果:(1)茜素红染色结果显示,经成骨矿化诱导液诱导的MC3T3-E1细胞产生了矿化结节,而正常对照组却没有出现矿化结节;荧光定量PCR的结果表明,与对照组相比,成骨标志性基因Runx2,ALP和OCN表达升高;western-blot结果表明,矿化诱导后成骨标志蛋白Runx2表达量升高。(2)实时荧光定量PCR的结果表明,MC3T3-E1细胞矿化后PRELP基因水平表达升高;western-blot结果表明,MC3T3-E1细胞矿化后PRELP蛋白表达水平升高。(3)实时荧光定量PCR的结果表明,RNA干扰后PRELP基因水平表达下降;western-blot结果表明,RNA干扰后PRELP蛋白表达水平下降。(4)实时荧光定量PCR的结果表明,干扰PRELP表达后,MC3T3-E1细胞矿化标志基因RUNX2表达下降;ALP染色结果表明,干扰PRELP表达后,MC3T3-E1细胞ALP活性下降;茜素红染色结果显示,干扰PRELP表达后,MC3T3-E1细胞矿化结节形成减少。(5)基因芯片结果显示干扰PRELP表达后MC3T3-E1细胞基因表达谱发生明显变化,且β-catenin为整个基因调控网络中的关键基因。(6)western-blot和免疫荧光结果表明,PRELP表达下降后β-catenin总蛋白水平和核转移明显下降,实时荧光定量PCR和western-blot结果表明,PRELP表达下降后可明显抑制connexin43基因水平和蛋白水平表达。结论:含MK430成骨分化诱导液促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化和矿化,我们成功构建了体外矿化细胞模型。实验结果表明PRELP在矿化诱导过程中表达量升高,干扰PRELP表达后,MC3T3-E1细胞体外矿化能力减弱,本研究首次证实PRELP具有促进成骨分化的功能,且该功能是通过β-catenin信号通路发挥作用的。