禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus)引起的一种易传染的肿瘤性疾病。ALV能够引起鸡群患肿瘤性疾病,除了对鸡群造成直接危害外,还可导致鸡群免疫失败,继发感染,产蛋率降低等,给我国养禽业带来了巨大的损失。到目前为止,该病还没有研制出可用的疫苗和有效的治疗药物,只能采取净化措施控制病毒的传播。P27蛋白为ALV的衣壳蛋白、群特异性抗原,目前常运用ELISA方法监测P27抗原达到净化鸡群的目的。本研究中在原核表达技术的基础上制备重组P27蛋白,建立检测P27抗体的间接ELISA方法,并同时将P27蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,分别制备单克隆抗体和多克隆抗体,建立检测P27抗原的夹心ELISA检测方法,为禽白血病的临床快速诊断提供了有效工具。具体内容包括：1.P27基因的原核表达ALV P27基因克隆至原核表达载体pET28a,构建pET28a-P27重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG16℃过夜诱导获得以可溶形式高效表达的P27蛋白,对P27蛋白进行镍亲和层析纯化,并经SDS-PAGE以及western blot证明,该P27蛋白的纯化效果好,具有与鸡阳性血清反应的免疫原性。2.禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立以P27蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgY作为二抗,建立禽白血病抗体间接ELISA检测方法。通过方阵滴定实验和各种优化条件的摸索,最终确定P27蛋白的包被浓度为0.183μg/mL,血清稀释度为1：500,HRP标记的羊抗鸡IgY稀释度为1：60000。经试验结果证明,该方法具有特异性好、敏感性高和重复性稳定等特点。该方法可用于ALV所有亚群抗体的检测,与IDEXX AB亚群和IDEXX J亚群抗体检测试剂盒的总符合率为85.7%。3.P27蛋白单克隆抗体的制备及鉴定以纯化的P27蛋白为免疫原,按照常规方法免疫6-8周龄的Balb/C小鼠,取该小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,通过细胞培养和有限稀释法制备单克隆抗体,最终获得6株能够特异性结合原核表达的P27蛋白的杂交瘤细胞株。经生物学特性分析,杂交瘤细胞染色体数均为90条左右。经间接免疫荧光鉴定2F3、5C2和5C7株单抗能与ALV发生特异性结合。4.P27蛋白多克隆抗体的制备及鉴定以纯化的P27蛋白为免疫原,按常规方法免疫日本大耳白兔,免疫效价达到1：64000。采取兔血清,对血清进行纯化,制备多克隆抗体。经试验验证,该多克隆抗体纯化效果较好,能够和ALV P27蛋白特异性结合。5.禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立将2F3株单抗作为捕获抗体,P27多抗作为检测抗体,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,建立检测禽白血病抗原的夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定实验和各种优化条件的摸索,最终确定2F3.株单抗的包被浓度为0.5μg/mL,多克隆抗体的稀释浓度为1.75μg/mL, HRP标记的羊抗兔IgG稀释度为1：7000。经试验验证,该方法具有特异性好、敏感性高和重复性稳定等特点,与IDEXX抗原检测试剂盒的符合率为99.3%。