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背景:心脑血管疾病已经成为威胁居民健康的首要原因,动脉粥样硬化引起的血管狭窄、闭塞以及粥样斑块破裂脱落导致的血管栓塞是组成心脑血管疾病的重要类型。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化性心血管疾病的重要危险因素,循环LDL-C升高与动脉粥样硬化的起病及发展有着直接联系,巨噬细胞吞噬过多的氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞是动脉粥样硬化发病的病理基础。循环LDL-C已经成为临床上评价降脂效果的最重要指标。miRNA参与脂代谢的调控,循环miRNA已经被证明可以用于疾病的诊断、治疗效果的评估以及预后评价,从临床样本(血清或病变组织)中筛查差异的miRNA表达已经成为研究miRNA与疾病关系的重要方向。目的:从临床样本探索脂代谢紊乱相关的miRNA,如能取得预期效果,或有助于进一步揭露脂代谢紊乱的潜在机制,为ASCVD疾病的早期诊断以及治疗提供新的思路。方法:1.收集从2017年3月至2017年12月在中国扬州大学附属医院就诊的门诊/住院病人及健康体检者。根据受试者血LDL-C水平,分为高脂组(n=30)及健康对照组(n=30)。分别从高脂组和健康对照组中按完全随机原则各抽取5例血清样本进行miRNAs血清表达谱分析,使用TargetScan,PITA及microRNAorg对差异表达的miRNAs进行靶基因预测,使用GO及KEGG数据库分析靶基因富集的功能及通路。2.继续收集高脂组及健康对照组样本,扩大实验样本量。统计两组受试者基本的临床信息,两独立样本T检验比较两组数据的差异:使用qRT-PCR检测并验证miR-933、miR-191-3p、miR-425-5p的表达(n=40);进一步在全部的122例高脂组受试者及168例健康对照组血清样本中检测并比较miR-933的表达趋势。Pearson相关性分析评估血清miR-933水平与血LDL-C的相关性。logistic回归分析评估miR-933下降是否为循环LDL-C升高的独立危险因素,ROC曲线评估miR-933对高LDL-C的预测价值。3.构建 ADCY9 3’UTR-PmirGLO 质粒,化学合成 miR-933 mimics、NC。使用 TargetScan数据库查询miR-933与ADCY9之间的结合位点,突变其结合位点,构建ADCY9 3’UTR mut-PmirGLO质粒,使用双荧光素酶报告基因实验检测miR-933与ADCY9之间有无转录调控关系。结果:1.miRNA芯片对两组血清的miRNAs表达谱进行分析比较,结果以差异大于2倍为筛选标准,共得到22种表达差异的miRNA,其中上调的有12种,包括:hsa-miR-320b、hsa-miR-6812-5p、hsa-miRNA-4442 等;下调的 miRNA 有 10 种,包括:hsa-miR-425-3p、hsa-miR-933、hsa-miR-191-3p 等。使用 TargetScan,PITA,microRNAorg 数据库对这些差异表达的miRNA进行靶基因预测,并对结果取交集,共得到616个预测靶基因。GO分析结果显示这些靶基因主要富集在蛋白结合、调节转录激活物活性、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性结合、调控钙离子结合等的分子功能。使用KEGG数据库对这些靶基因富集的通路进行Pathway分析,结果筛选出靶基因富集最多的前20个信号通路,包括Hippo signaling pathway、Focal adhesion、PI3K-Akt signaling pathway 等。2.初步选择 miR-933、miR-191-3p、miR-425-3p 三种差异表达 miRNAs,使用 qRT-PCR 对其表达趋势进行初步验证(n=40),结果显示这三种miRNA的表达趋势与芯片报告的结果基本一致。大样本qRT-PCR进一步验证miR-933的表达趋势(n=290),Pearson相关性分析结果显示血清miR-933与LDL-C呈显著负相关(R=-0.691);多变量logistic回归分析结果显示,血清 miR-933 降低(OR 0.339,95%CI 0.138-0.829,P=0.018)为高血 LDL-C 水平的独立危险因素;绘制ROC曲线,结果显示曲线下面积AUC为0.7388(95%CI,0.6822-0.7995),提示miR-933对以血LDL-C代谢紊乱为特征的高脂血症具有一定的预测价值。3.构建ADCY9 3’UTR质粒并通过化学方法合成了 miR-933 mimic及阴性对照NC序列,并于293T细胞中进行双荧光素酶报告基因实验进一步验证两者的关系,结果显示miR-933可通过绑定ADCY9 3’UTR来降低其荧光素酶活性,而在NC组miR-933不能降低ADCY93’UTR荧光素酶的活性,突变其结合位点后,miR-933也不能降低ADCY93’UTR-mut的荧光素酶活性,证明了 miR-933可以通过ADCY9 3’UTR来降低其转录活性,即ADCY9是miR-933的下游靶基因。结论:发现了几种可能参与循环LDL-C调控的miRNA,其中miR-933下调与LDL-C升高关系最为密切;ADCY9是miR-933的直接靶基因,miR-933可能通过ADCY9基因参与脂代谢的调控过程。