二十世纪九十年代发展了基因组、转录组、蛋白组和代谢组的等“组学”，并产生了“自上而下”的系统生物学，二十一世纪初在此基础上进一步诞生了具有工程化特点的“自下而上”的合成生物学。构建简约化、模块化、功能明晰、便捷操作的“底盘细胞”是合成生物学的一项重要内容，发展高效遗传操作的使能技术是实现合成生物学的重要支撑。本论文探索了天然分散的大肠杆菌脂肪酸生物合成基因进行人工成簇化、功能模块化、定量启动表达等研究。在此基础上，初步构建了人工成簇化的大肠杆菌全部生存必需基因。利用Cas9蛋白高效定点切割特点和酿酒酵母高效同源重组能力，发展了体内拼接超过1Mbp基因组的新技术。　　论文第一部分对天然分散的大肠杆菌脂肪酸生物合成基因进行人工成簇化、模块化、定量化，并进而尝试大肠杆菌全部生存必需基因的成簇化、模块化。将大肠杆菌16个脂肪酸生物合成基因划分为前体、起始、延伸、释放、辅助和降解等模块，并在酵母菌中拼接在一起，拼接得到的人工成簇化、模块化质粒导入大肠杆菌MDS42后，将基因组上天然分散的16个脂肪酸生物合成基因进行逐一删除，构建了全部脂肪酸生物合成基因的人工成簇化、模块化的菌株FFA27，该菌株在完全培养基上生长状态良好。测试发现，8个脂肪酸生物合成基因可以在4种不同强度的定量启动子下表达，并可以替换基因天然的启动子。对FFA27菌株进行全细胞脂肪酸分析，不饱和脂肪酸比例提高到25.5％，而C16∶0的比例由31.2％下降到23.4％，RNA-seq分析表明这是由于FFA27菌株脂肪酸合成基因fabH、fabD、fabG、fabF基因表达量降低，而fabI、fabA和tesA基因表达量升高造成的。在脂肪酸生物合成基因成簇化、模块化的基础上，可以方便对整个脂肪酸代谢途径基因的表达进行优化组合。另外，分析总结了大肠杆菌生存必需基因共449个，可分为19个功能群，目前已在酵母菌中对449个基因完成一级拼接（共34个质粒），为构建一个人工成簇化、模块化的“高速代谢公路网络”的大肠杆菌底盘细胞奠定基础。　　论文第二部分建立了一种名为“Cas9切割促进同源重组拼接（Cas9-facilitatedHomologous Recombination Assembly，CasHRA）”的大片段DNA体内拼接技术。该方法的原理是利用Cas9可以高效率、定点切割多个DNA片段，结合酿酒酵母具有高效的体内同源重组能力的特点，一次将2或3个大的环型DNA定点切割并通过同源重组在体内拼接成一个更大的环型DNA。具体操作包括将酵母中三个不同标记的供体质粒pAEEG4(Lys-)、pAEEG5(His-)、pAEEG6(Ura-)和一个Cas9组成表达的pMet-Cas9(Met-)质粒通过醋酸锂转化的方法（也可通过酵母原生质体融合的方法）转入同一酵母细胞中，然后共同导入线性化载体pCriv0和引导RNA(sgRNA，single-guide RNA)表达质粒pTrp-gRNA。表达sgRNA引导Cas9切割三个供体质粒，释放出供体片段，因供体片段及线性化载体之间依次含有500bp左右的重叠序列，利用酿酒酵母的同源重组能力，将四个片段拼接成48 kbp的环形DNA。引入的pTrp-gRNA质粒，可以通过半乳糖诱导引导RNAsgRNA-S0表达，sgRNA-S0引导Cas9切割pTrp-gRNA，达到消除pTrp-gRNA的目的，以便进行下一轮的拼接。基于CasHRA拼接技术，经过5个级别的拼接，我们完成了大肠杆菌449个生存必需基因和267个大肠杆菌生长重要基因的拼接，拼接后得到的基因组大小为1.03Mbp，拼接阳性率达到65％。此技术不需要进行体外操作大片段DNA，减少了困难且低效率的大片段DNA的体外操作，使大片段DNA的拼接变得简单易行，具有应用于更大基因组DNA(＞1Mbp)拼接的潜力。