研究背景:目前治疗血液系统各类恶性疾病的常用手段包括化疗、放疗、异基因造血干细胞移植等。这些治疗手段常常导致机体相应的组织器官出现不同程度的损伤。除了受损脏器自身功能出现相应表现外,免疫系统和粘膜屏障功能的破坏还会使机体招致致命性的感染。近年来造血干细胞移植和细胞因子的应用日趋广泛,许多研究致力于将干细胞应用于各种受损的组织器官,以利用其多向分化潜能以及分泌细胞因子等发挥修复组织的作用。脂肪源间充质干细胞(ADSCs)来源于脂肪组织,是一种具有多向分化潜能的干细胞,还有分离方便、免疫原性小的特点,允许同种异体移植而没有免疫排斥,不具有伦理争议等优势。具有定向分化、免疫调节等多种作用,因而得到了广泛关注。目前有许多研究致力于对ADSCs修复作用观察与研究。从而为组织损伤修复带来新的解决方法。本研究拟利用脂肪来源的间充质干细胞,在小鼠体内对化疗损伤脏器进行实验性治疗修复,观察其是否对损伤组织具有修复能力。实验共分为两部分,一部分是应用重组腺病毒(p Adxsi–EGFP)转染ADSCs,将荧光标记的细胞注入组织受损的个体内,利用荧光物质的示踪作用观察ADSCs进入体内后的分布情况以及对损伤组织有无趋化能力。另一部分研究是将ADSCs注入受损个体内,观察化疗后受损组织在ADSCs的作用下,修复的速度及程度上与空白组相比是否存在优势。目的:1采用化疗处理的小鼠,将荧光标记的ADSCs注入体内,观察ADSCs在体内的分布情况及对损伤组织是否具有趋化能力。为干细胞对受损组织的修复作用提供证据。2通过对比ADSCs注入后治疗组与对照组受损组织的修复程度与速度的差异,间接证明ADSCs是否对受损组织具有修复能力。1通过体外分离培养BALB/c小鼠脂肪组织获得ADSCs,采用对数生长期的细胞,用p Adxsi-EGFP标记ADSCs,用荧光显微镜查看转染率,并进行流式细胞学检测。MTT法检测转染后细胞的增殖活性。2 BALB/c小鼠6只,随机分为2组,其中3只经由腹腔注射环磷酰胺(CTX)建立化疗损伤的小鼠模型,设为实验组,3只腹腔注射生理盐水作为对照组。将标记的ADSCs由小鼠尾静脉注射入6只小鼠体内,观察点为第3、7、10、14天,采用活体成像技术检测荧光标记在活体组织中的分布规律及对受损组织是否有优势分布的现象。3化疗损伤的小鼠模型24只,由腹腔注射CTX得到,随机将小鼠分为治疗组和对照组,每组12只。将体外分离培养得到的ADSCs经尾静脉注射到治疗组小鼠模型体内,对照组注射相同成分的等体积的培养液作对照。两组小鼠每小组3只,分成4个小组,分别于第3、7、10、14天处死各组小鼠,取小鼠肺、食管、脾脏、肾脏、小肠进行石蜡切片,取小鼠胸腺进行冰冻切片,HE染色后,观察不同时段各组相应脏器损伤的修复情况。结果:1体外分离、培养小鼠ADSCs并成功传代培养后,用p Adxsi-EGFP转染ADSCs,12小时后即可见荧光表达,随着时间的推移荧光表达逐渐增强。48小时观察荧光表达趋于稳定,荧光表达随病毒稀释液浓度增加而增加,当MOI为100时,荧光表达率最高,流式细胞仪检测荧光转染率为80%,且细胞形态正常,未见细胞变形、脱落等情况,表示细胞未受损。以MOI为100的病毒转染ADSCs,同未转染的ADSCs一同应用MTT法检测细胞增殖活性,描绘生长曲线,结果显示病毒转染后的ADSCs增殖活性未受影响。2 6只小鼠在成功尾静脉注射后正常存活,于各个时间点通过小动物活体成像仪观察对照组3只及实验组(注射CTX组)3只均未见有荧光聚集表现。无法在体外追踪到荧光细胞去向。3胸腺组织在化疗后第3天即有明显损伤,皮髓质界限开始模糊,皮质区淋巴细胞开始出现变性,细胞开始溶解坏死,髓质区胸腺小体减少。而此后各时间点组织修复程度相比较,对照组胸腺组织在第10天时细胞数量开始逐渐增多,说明修复的发生,而治疗组在第7天时细胞坏死程度方法:即低于对照组,且此后细胞数量明显增多,说明治疗组胸腺的修复速度要更快,ADSCs可以修复化疗损伤的胸腺。脾脏在化疗后第3天治疗组及对照组均出现脾小结结构不清晰,脾脏白髓和红髓边界模糊,细胞数量减少。但继续观察,对照组在14天,细胞数量开始逐渐增多,说明脾脏的自我修复开始,而治疗组脾脏在第10天损伤较前已经改善,第14天时白髓和红髓的界线已经可以辨别,细胞的数量也基本恢复。说明ADSCs对脾脏有明显的修复作用。食管在化疗后第3天,对照组和治疗组均可见上皮层的连续完整性被破坏,基底细胞层可见液化,对照组在第14天时,基底细胞层液化细胞开始减少,但仍然存在。治疗组在第7天,基底细胞层液化细胞数量就已经明显减少,第14天时已基本恢复正常。说明ADSCs对化疗损伤的食管有明显的修复作用。肾脏在化疗后第3天损伤即可出现。皮质和髓质边界不清晰,组织结构杂乱无序,部分肾小球细胞变性肿胀,肾小球囊变得不明显,肾小管轮廓不清,肾小管上皮细胞边界不清,细胞浊肿明显,管间排列紊乱,管腔扩张或闭合。对照组肾脏随着时间推移损伤程度并无明显加重,第14天细胞水肿情况有所改善。化疗后第3天治疗组和对照组肾脏损伤程度无差别,第10天时,治疗组在镜下观察细胞肿胀稍有缓解,提示已有所修复,而对照组尚不明显。第14天时治疗组肾小管轮廓较前清晰,而对照组尚未能见到清晰肾小管轮廓。说明给予ADSCs治疗的小鼠肾脏比对照组肾脏修复速度快,ADSCs对化疗损伤肾脏有一定修复作用。小肠的对照组化疗后第3天多见小肠绒毛变短或不规则,部分微绒毛脱落,随着时间的推移损伤没有进一步加重。化疗后小肠各个时间点的病理变化,治疗组同对照组无明显区别。ADSCs对化疗损伤的小肠组织的修复作用尚未证实。肺组织在化疗后无明显损伤。结论:1 PAdxsi-EGFP可以高效、安全的转染ADSCs,但是对照组及观察组均未见有荧光聚集现象,无法在体外追踪到荧光细胞去向。2 ADSCs对化疗损伤的胸腺、食管、脾脏、肾脏均具有不同程度的修复作用,对损伤较重的器官如胸腺、脾脏、食管的修复作用更为明显,肾脏次之,对小肠损伤的修复仍待进一步研究。