【摘 要】
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研究目的:构建偶联抗人FcεRⅠα单克隆抗体（m Ab）的磁性CuInS2/Zn S核壳量子点微球,建立MCs活化相关分子sFcεRⅠα和IgE的流式微球检测方法,评价自建新方法性能,验证其检测的灵敏度、特异性、线性范围、精密度和稳定性等特征,分析其在体外检测中的效能,探索自身免疫病中是否存在MCs活化现象。研究方法:（1）应用RT-PCR技术获得人IgE Cε3-Cε4区基因,对该基因进行克隆与
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（No.81401335,81471593,81601395）； 上海申康医院发展中心临床辅助科室能力建设项目（No.SHDC22014005）； 上海市科委项目（No.14411963200,15431901900）； 上海交通大学医工交叉青年项目（No.YG
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研究目的:构建偶联抗人FcεRⅠα单克隆抗体（m Ab）的磁性CuInS2/Zn S核壳量子点微球,建立MCs活化相关分子sFcεRⅠα和IgE的流式微球检测方法,评价自建新方法性能,验证其检测的灵敏度、特异性、线性范围、精密度和稳定性等特征,分析其在体外检测中的效能,探索自身免疫病中是否存在MCs活化现象。研究方法:（1）应用RT-PCR技术获得人IgE Cε3-Cε4区基因,对该基因进行克隆与表达,通过western blot、流式细胞术等方法鉴定获得蛋白的免疫学活性,为后续实验提供标准物质;（2）用本课题组保存的FcεRⅠα重组蛋白免疫小鼠,采用有限稀释法制备鼠抗人FcεRⅠα单克隆抗体,采用间接ELISA以及流式细胞仪对m Ab进行初步筛选与鉴定;（3）利用SPG膜技术制备CuInS2/Zn S量子点微球,摸索抗人FcεRⅠαm Ab化学偶联条件、m Ab包被量、微球数量、孵育温度、孵育时间等关键参数,建立血清可溶性IgE高亲和力受体sFcεRⅠα和IgE的流式微球定量检测方法,依照CLSI指南确定标准曲线及检测下限,通过回收实验、批内、批间重复性实验等方法验证方法的精密度和稳定性等性能;（4）在上述基础上,收集89例SLE患者、40例AILD患者和64例健康对照者血清样本,对sFcεRⅠα和IgE水平进行定量检测与统计分析,验证方法的正确性和检测能力。研究结果:（1）成功构建IgE Cε3-Cε4原核表达体系,获得的原核蛋白保留了IgE抗原性;（2）通过间接ELISA获得一对配对抗体A8H1和D7C1,可用于双抗夹心实验,经流式细胞术验证,B5A11抗体与转染了人FcεRⅠα的CHO3D10细胞和表达了人FcεRⅠα的KU812细胞结合率高,是一株良好的流式细胞应用抗体;（3）成功建立血清可溶性IgE高亲和力受体sFcεRⅠα和IgE的流式量子点微球定量检测方法,所建方法灵敏度高、特异性好,批内及批间重复性实验的平均回收率在80%-110%,相应的CV<20%,满足免疫分析的验收标准;（4）新方法在处理血清样品时显示出良好的工作性能,实验发现SLE患者血清sFcεRⅠα和IgE水平较健康对照显著升高（P<0.05）,AILD患者血清sFcεRⅠα水平升高（P<0.05）,IgE与健康对照无显著差异（P>0.05）,sFcεRⅠα和IgE水平在SLE患者与AILD患者间无显著差异（P>0.05）。研究结论:本课题成功建立了一种更加灵敏的血清MCs活化相关分子sFcεRⅠα和IgE流式量子点微球定量检测方法,方法具有更广的检测范围,更加方便且稳定好,实现了在同一检测体系比较sFcεRⅠα和IgE水平而避免产生偏倚。另外,在部分自身免疫病患者血清中可以检测到MCs活化相关生物标志物,这些结果提示量子点流式微球检测sFcεRⅠα和IgE的新方法具有潜在临床推广应用价值。所建立的IgE原核表达载体和抗人sFcεRⅠα单克隆抗体为相关实验研究提供了保障。
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