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研究目的: 通过在293细胞中建立Tet-On诱导基因表达系统，检测该系统是否能诱导TROP2蛋白的表达，并探讨TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭功能方面的作用。 研究方法: 1.Tet-On-Advanced稳定细胞株的构建 用Tet-On-Advanced质粒转染293细胞，通过G418筛选，RT-PCR法检测四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，筛选转染阳性克隆。通过pTRE-Tight-Luc载体转染上述阳性转染克隆，经强力霉素(DOX)诱导荧光素酶表达，用萤火虫荧光素酶试剂盒检测，验证Tet-On系统，筛出稳定细胞株。 2.DOX调节293细胞中TROP2蛋白的表达 构建含TROP2基因的重组载体pTRE-Tight-TROP2:采用PCR扩增TROP2基因，提取pTRE-Tight质粒，EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切TROP2基因与pTRE-Tight质粒，T4连接酶连接酶切产物，转化感受态DH5α，挑单克隆菌株摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，取阳性株提取重组质粒，送公司测序。 将pTRE-Tight-TROP2转染进Tet-On-Advanced稳定转染株，设立不同实验组:Ⅰ组:不转染pTRE-Tight-TROP2质粒组;Ⅱ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且加DOX(1000ng/ml)组;Ⅲ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且不加DOX组。RT-PCR检测不同组细胞的TROP2基因，FCM检测不同组细胞的TROP2蛋白表达。 3.TROP2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用 通过增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验与Transwell侵袭实验检测TROP2蛋白功能。 研究结果: 1.Tet-On-Advanced稳定细胞株的构建 Tet-On-Advanced质粒转染293细胞，经过G418筛选和亚克隆，获得21株单克隆细胞株，扩大培养。RT-PCR检测21株单克隆细胞株中四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，结果显示，21株单克隆株中，有10株检测到rtTA基因，编号为1-10。从10株细胞株中，用萤火虫荧光素酶检测试剂盒挑选稳定转染细胞株，结果显示，加DOX组的荧光素酶活性检测结果明显高于不加DOX组，从中选出荧光度值高于3000的4株细胞（1、2、6、9、号细胞株）为候选细胞。考虑到本底的因素，1号细胞株被选出做为转染效果最好的细胞株，用于后续试验。 2.DOX调节293细胞中TROP2蛋白的表达 PCR法扩增TROP2基因，结果显示有大小为969bp的条带，与预期结果相符。TROP2基因与pTRE-Tight载体经双酶切、连接、转化DH5α感受态细菌、涂板，挑10个单克隆菌落进行摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，得2株阳性菌株。提取质粒，电泳显示大小均为3574bp，与预期结果一致。核酸序列分析结果证明其序列正确，表明所得质粒为重组质粒pTRE-Tight-TROP2。 pTRE-Tight-TROP2重组质粒转染Tet-On-Advanced稳定细胞株，经DOX诱导，RT-PCR法检测3组细胞中TROP2基因的表达水平，FCM法检测3组细胞中TROP2蛋白的表达水平。结果显示，加DOX组细胞中TROP2基因、蛋白的水平明显高于对照组。 3.TROP2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用 MTT法检测细胞生长、增殖情况，结果显示，加DOX组细胞增殖速度明显比对照组细胞快;划痕实验与Transwell迁移实验用于检测细胞迁移功能，拍照记录、MTT检测与结晶紫染色结果显示，加DOX组细胞迁移能力明显高于对照组;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭功能，通过细胞计数及结晶紫染色，结果表明，相对于对照组，加DOX组细胞的侵袭功能明显升高。 研究结论: 在293细胞中成功构建了稳定的Tet-On诱导表达系统，且诱导表达效果较为显著。构建重组质粒pTRE-Tight-TROP2，将其转染制各好的Tet-On-Advanced稳定细胞株，在诱导剂DOX作用下，成功诱导了TROP2蛋白的表达，并通过一系列实验证明TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭能力上有显著作用。