目的和意义鼻咽癌是我国南方地区高发的头颈部恶性肿瘤,易发生早期转移,确诊的鼻咽癌病例中有60%以上已有颈淋巴结转移或远处转移,而一旦发现转移病灶患者中位生存期不超过1年。因此,研究鼻咽癌发生和转移的分子机制,对提高鼻咽癌治疗疗效,延长患者生命有重要的临床指导意义。microRNA分子是一类非编码小RNA,通过和靶基因3-UTR区结合抑制靶基因的转录或翻译,而其中的miR-9分子除参与胚胎神经发育、糖尿病和维护心肌功能外,还作为细胞增殖和分化的主控基因,参与Burkitt淋巴瘤、非霍奇金B细胞淋巴瘤、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤的发生和转移,但miR-9究竟是抑癌基因还是癌基因因组织类型不同尚无定论,且在鼻咽癌甚至其他头颈部肿瘤miR-9的表达及功能研究尚无报道。趋化因子受体-4(chemine receptor-4, CXCR4)是目前研究较为深入的趋化因子受体,文献报道CXCR4在多种恶性肿瘤的发生发展和转移中起重要作用,且与鼻咽癌的转移和预后密切相关。我们通过生物信息学方法分析发现miR-9分子存在能和CXCR4 3’-UTR相应序列结合的“种子序列”,提示两者之间可能存在直接的靶向调控关系,但仍需相关的实验证据去证实。因此,本实验拟研究miR-9在慢性鼻咽炎组织和不同转移潜能的鼻咽癌组织、永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞中的表达情况；通过5-AZA和TSA处理C666-1细胞后检测miR-9的表达变化和相应编码基因的甲基化状态变化,进而研究miR-9在鼻咽癌中表达失调是否与相应的编码基因启动子区CpG岛DNA甲基化相关,明确miR-9表达失调的分子机制。通过筛选miR-9过表达的C666-1细胞和体内外功能实验,明确miR-9对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移的影响；通过构建和miR-9结合的CXCR4 3’-UTR双荧光报告质粒及上述体内外功能实验,探讨miR-9和CXCR4之间是否存在直接的靶向调控关系,miR-9能否部分逆转CXCR4在鼻咽癌中的生物学功能；方法1.临床标本收集和分组收集2008年10月至2010年12月来我科就诊并活检的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织,共60例,包括40例鼻咽癌组织(其中无转移者20例,伴转移者20例)和20例慢性鼻咽炎组织(对照组),患者临床资料齐全,所有标本均行HE染色确诊,同时行miR-9原位杂交检测,并分析其表达与患者临床资料之间的相关性。2.鼻咽癌细胞株的培养鼻咽癌细胞C666-1、Sune-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2和Hone-1以RP1640+10%FBS培养,正常的永生化鼻咽上皮细胞NP69以KMSF培养基培养,按常规条件消化传代。3. Real time-PCR:抽提细胞内小分子RNA和总RNA,逆转录成cDNA后利用Taqman探针或引物进行PCR扩增,以2-ΔΔCt值表示基因相对表达强度。4.原位杂交：石蜡组织和细胞爬片经组织脱蜡和水化(4%多聚甲醛固定)、胰酶消化(细胞透化)、预杂交、杂交、封闭、抗地高辛标记的一抗(1：1000)4℃孵育过夜、BCIP/NBT缓冲液洗涤、BCIP/NBT染色、核固红复染、封片等步骤后,显微镜下观察染色结果,并进行结果判读,判定标准同免疫组化结果的判读。5.去甲基化药物5-AZA和去乙酰化药物TSA处理C666-1细胞将鼻咽癌细胞C666-1以1×105的密度接种于6孔板中,生长过夜后加入终浓度为50uM的5-AZA,每隔24小时换含上述浓度的5-AZA的完全培养基一次,连续处理3天后收集细胞(5-AZA组),或在连续加入终浓度为50uM的5-AZA作用3天后继续加入终浓度为10nm的TSA维持作用24小时后收集细胞(5-AZA+TSA组),检测miR-9的表达变化和miR-9编码基因的甲基化状态变化。6.hsa-miR-9-1, hsa-miR-9-2和hsa-miR-9-3启动子区的CpG岛预测：利用CpG Island Searcher软件对编码hsa-miR-9的基因hsa-miR-9-1, hsa-miR-9-2和hsa-miR-9-3启动子区的CpG岛进行分析,以相应1microRNA之cDNA的转录起始位点为+1,对基因上游1000bp到下游1000bp共2000bp的区段序列,以GC=55%, ObsCpG/ExpCpG=0.65, Length=300或200,Distance=100作为搜索参数进行分析。7.重亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing, BSP):抽提细胞基因组DNA、亚硫酸盐处理基因组DNA使得非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,同时使甲基化胞嘧啶保持不变,再以亚硫酸盐处理过的基因组DNA为模板,根据启动子CpG岛预测结果设计相应引物,利用高保真酶Platinum Taq Hifidility扩增目的片段BS-9-1、BS-9-2和BS-9-3,PCR产物凝胶回收后与pMD19-T载体连接,连接产物涂板并摇菌、质粒小抽后进行DNA测序检测甲基化情况。8.载体的构建与鉴定①pLVTHM/miR-9的构建及鉴定合成pre-miR-9转录模板正义链和反义链的DNA Oligo序列,退火形成DNA双链后与pLVTHM载体同时进行MluI和ClaI双酶切,连接以构建载体pLVTHM/miR-9。②psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR及其突变体的载体构建与鉴定以正常人外周血基因组DNA为模板构建载体psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR(XhoI和NotI双酶切),同时运用重叠PCR技术对psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR的靶序列进行替换突变和缺失突变,构建载体psiCHECK-2-mt-s-CXCR4 3’-UTR(替换突变)和psiCHECK-2-mt-d-CXCR4 3’-UTR(缺失突变)。③pReceiver-CXCR4-ORF和pReceiver-CXCR4-ORF+3’-UTR质粒的构建与鉴定以正常人外周血基因组DNA为模板构建载体pReceiver-CXCR4-ORF和pReceiver-CXCR4-ORF+3’-UTR。9.慢病毒的包装及滴度测定：病毒包装用293FT细胞生长融合度达70%—80%时用磷酸钙转染法进行病毒包装。转染6h后换液,48-72h后荧光显微镜下观察,发现大多数细胞发出绿色荧光时收集病毒上清,再以梯度稀释法测定慢病毒滴度。10.筛选miR-9过表达的C666-1细胞慢病毒悬液感染鼻咽癌C666-1细胞,荧光显微镜下观察表达绿色荧光的细胞比例超过30%时用流式细胞仪分选GFP+细胞,命名为C666-1/miR-9和C666-1/pLVTHM,荧光定量RT-PCR鉴定GFP+细胞中miR-9的表达,以western-blot法(或免疫荧光)检测CXCR4蛋白的表达。11.Western blot:抽提细胞总蛋白、BCA蛋白定量法检测总蛋白的浓度后按昭SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、显影和定影的步骤进行Western blot检测。12.免疫荧光：细胞爬片以4%多聚甲醛固定30分钟,0.2%Triton X-100处理5分钟,10%正常山羊血清封闭30分钟后以CXCR4一抗(1：100稀释)4℃孵育过夜、荧光标记二抗(1：200)室温湿盒避光孵育1小时,DAPI室温湿盒避光孵育5分钟后镜检、拍照。13.体内外功能实验：①CCK-8检测细胞增殖能力：96孔板中每孔接种1000个细胞,每孔体积为200u1,每组5孔,同时设置空白对照,分别培养1-5天。每孔加入CCK8工作液20u1,37℃继续培养1h后终止培养,以空白对照孔调零,酶标仪上450nm测定各孔吸光度值(OD值),以相应OD比值表示细胞增殖能力大小。②平板克隆形成实验：胰酶消化细胞后制成单细胞悬液,6孔板中每孔种入200个细胞,完全培养基中培养10-14天,待形成明显的细胞集落时4%多聚甲醛固定30min, PBS清洗后1%结晶紫染色10min,显微镜下计算含50个细胞以上的克隆数。③细胞凋亡状态的检测：利用流式细胞仪检测、Caspase-3活性分析和Tunel原位凋亡检测细胞的凋亡状态。④划痕实验：待细胞密度达到90%左右,吸干培养基,用200u1的加样枪头垂直在培养孔中部轻轻划过,制造多条互相平行的划痕,力度以刮落细胞而不在培养板上留痕为准。培养液冲去脱落细胞后继续培养,在制作划痕12h后对越过划痕边缘向空白处移动生长的细胞进行计数。⑤Transwell迁移实验：胰酶消化细胞后以无血清培养基洗涤细胞并制作细胞悬液,均匀加入200u1至transwell小室上腔,加入600u1完全培基至transwell小室下腔,放置12小时后取出,PBS洗涤后4%多聚甲醛固定20min,1%结晶紫染色液染色10min,显微镜下计数穿膜细胞数。⑥Transwell侵袭实验：细胞在进行Transwell侵袭实验前先血清饥饿24h,胰酶消化细胞后以0.5 ml无血清培养基重悬细胞(5×104)并加入transwell小室上腔的Matrigel基质胶表面,transwell小室下腔加入完全培养基作为趋化物。放置12小时后取出,PBS洗涤后4%多聚甲醛固定20min,1%结晶紫染色液染色10min,显微镜下计数穿透基质胶的细胞数。⑦裸鼠皮下成瘤实验：选择4-6周龄BALB/C-nu/nu雄性裸鼠,体重20-24g进行裸鼠皮下成瘤实验。裸鼠背部皮下注射4×106细胞后定期观察肿瘤的生长情况,并以公式volume=1/2×xa×b2计算肿瘤的体积(a代表肿瘤的最长径,b代表肿瘤的最短径,单位为cm),当肿瘤体积接近500cm3时终止饲养。⑧体内转移实验选择4-6周龄的BALB/c nu/nu雄性裸鼠,体重18-24g,建立肝包膜下种植肺转移动物模型,待肝包膜下成瘤后利用动物整体成像系统观察体内肿瘤组织发出的绿色荧光,处死裸鼠HE染色观察肿瘤细胞在肝肺内转移情况。14.miRNA靶标预测通过常见的生物信息学软件PicTar(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirbase.org)、Targetscan(http://pictar.mdc-berlin.de/)来预测miR-9分子可能调控的靶基因,取3个软件预测结果的交集,确定我们感兴趣的靶基因。15.双荧光素酶报告实验：采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行双荧光素酶活性分析。转染前一天,将293FT细胞(2×105)接种到24孔板中,每孔加入500u1无抗生素的培养基,待细胞融合度达到95%时进行转染,转染48h后收集裂解细胞并检测双荧光素酶活性,以Firefly luciferase与Renilla luciferase的活性比值作为双荧光素酶的相对活性。16.统计学分析所有数据均采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。慢性鼻咽炎组织、无转移鼻咽癌组织、伴转移鼻咽癌组织中CXCR4蛋白表达水平的比较、hsa-miR-9表达水平的比较采用多个独立样本非参数检验(K independent samples test) (Kruskal-Wallis检验),CXCR4蛋白与hsa-miR-9表达水平的相关性分析采用Sperman等级相关。荧光定量PCR比较不同细胞株中miR-9的表达时采用单因素方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法。方差不齐时采用基于方差不齐的多重比较方法Dunnett’s T3法。平板克隆实验、划痕实验、(?)ranswell迁移实验、(?)ranswell侵袭实验等两样本均数的比较均采用两独立样本的t检验(independent-samples Ttest)；CCK8实验、皮下成瘤实验采用析因设计的方差分析；不同细胞间肝肺转移率的比较采用两个独立样本率比较的X2检验；C666-1、C666-1 5-AZA和C666-1 5-AZA+TSA三组之间miR-9表达水平的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), BSP结果的比较采用R×C表资料的X2检验进行统计学分析。结果l.hsa-miR-9在鼻咽癌组织和细胞中低表达miR-9阳性表达于慢性鼻咽炎鼻咽上皮细胞和癌细胞的胞核和胞浆,以胞核为主,呈蓝褐色颗粒状。鼻咽癌组织中miR-9的表达水平(平均秩次22.25)显著低于慢性鼻咽炎组织(平均秩次47.00)(Z=-5.218,P=0.000)。在鼻咽癌不同T分期、N分期和临床分期miR-9的表达差异均有统计学意义(Z=20.477,P=0.000；X2=14.423,P=0.002；X22=17.561,P=0.001),随着T分期、N分期和临床分期的不断增高,miR-9的表达水平逐渐降低,其中T3-T4期明显低于T1-T2期,N3期明显低于N1-N2期,Ⅳ期明显低于Ⅰ-Ⅲ期,且NO期miR-9的表达水平(平均秩次30.56)显著高于N1-N3期(平均秩次17.58)(Z=-2.992,P=0.002),从而说明miR-9的表达与鼻咽癌的发生、转移及进展相关。以ΔCt值表示miR-9的相对表达水平,鼻咽癌细胞株中NP69细胞miR-9的表达水平(18.00±0.10)显著少于C666-1 (27.19±0.11)、Sune-1 (25.80±0.22)、5-8F (23.77±0.13)、6-10B(24.76±0.07)、CNE-1(24.16±0.12)、CNE-2(22.92±0.14)和Hone-1(26.77±0.21)细胞,差异有统计学意义(F=1212.097,P=0.000)。多重比较结果显示转移能力最强的C666-1细胞miR-9的表达水平均低于转移能力较弱的5-8F和CNE-2(P=0.000),均低于无转移能力的6-10B和CNE-1(P=0.000)。2.miR-9表达下调与其编码基因hsa-miR-9-1, hsa-miR-9-2和hsa-miR-9-3启动子区CpG岛甲基化有关①hsa-miR-9-1, hsa-miR-9-2和hsa-miR-9-3启动子区CpG岛分布：我们利用CpG Island Searcher软件对hsa-miR-9-1、hsa-miR-9-2和hsa-miR-9-3启动子区的CpG岛进行分析,结果表明hsa-miR-9-1 165bp-1255bp之间共1091bp区域存在一个CpG岛,其中GC比例为62.1%,ObsCpG/ExpCpG为0.741,共含有18个CpG二核苷酸；hsa-miR-9-2 3bp-203bp之间共201bp区域存在一个CpG岛,其中GC比例为55.2%,ObsCpG/ExpCpG为0.756,共含有9个CpG二核苷酸；hsa-miR-9-3 87bp-1899bp之间共1813bp存在一个CpG岛,其中GC比例为65.4%, ObsCpG/ExpCpG为0.739,共有35个CpG二核苷酸。②5-AZA和TSA药物干预鼻咽癌细胞C666-1后miR-9重新表达及编码基因部分去甲基化5-AZA和TSA能诱导C666-1细胞miR-9基因重新表达,C666-1 5-AZA组、C666-15-AZA+TSA组同C666-1组相比,miR-9表达水平分别上调11.31倍和22.63倍,差异有统计学意义(F=780.280,P=0.000),组间比较发现C666-1 5-AZA组、C666-15-AZA+TSA组miR-9表达水平显著高于C666-1组(P=0.000),且C666-15-AZA+TSA组亦显著高于C666-1 5-AZA组(P=0.000)。BSP DNA测序结果显示C666-1、C666-1 5-AZA、C666-1 5-AZA+TSA三组has-miR-9-1的甲基化比率分别为78.8%(67/85)、32.9%(28/85)和14.1%(12/85),差异有统计学意义(Z=77.324,P=0.000); has-miR-9-2的甲基化比率分别为72.2%(39/54)、38.9%(21/54)和14.8%(8/54),差异有统计学意义(χ2=36.850, P=0.000); has-miR-9-3的甲基化比率分别为76%(133/175)、32%(56/175)和20.6%(36/175),差异有统计学意义(X2=122.407,P=0.000),C666-1细胞has-miR-9-1、has-miR-9-2和has-miR-9-3甲基化率最高,C666-1-AZA组次之,C666-1-AZA+TSA组最低,说明5-AZA和TSA能改变C666-1细胞miR-9编码基因的甲基化状态,换言之,启动子甲基化和去乙酰化是鼻咽癌细胞miR-9表达下调的主要原因。3.miR-9过表达对鼻咽癌细胞C666-1生物学功能的影响为证实miR-9对鼻咽癌细胞C666-1生物学功能的影响,我们构建了miR-9过表达载体,筛选出miR-9过表达的C666-1/miR-9细胞,并进行了一系列体内外功能实验：CCK8法结果示细胞种植后的第二天开始,C666-1/miR-9细胞的增殖速度显著慢于C666-1/PLVTHM细胞(F=696.168,P=0.000)；平板克隆形成实验示C666-1/miR-9细胞形成的平板克隆数(48.15±3.82)显著少于对照组C666-1/PLVTHM细胞(83.70±3.74)(t=-29.746,P=0.000),说明miR-9过表达可抑制鼻咽癌的增殖和平板克隆形成能力；C666/miR-9和对照组C666-1/PLVTHM细胞均未出现明显的细胞凋亡,说明miR-9过表达不影响鼻咽癌细胞的凋亡；划痕实验中C666-1/miR-9细胞穿越划痕的细胞数(47.167±2.552)较对照细胞C666-1/PLVTHM (95.917±3.118)明显减少(t=-41.912,P=0.000),穿越transwell膜的细胞数(36.500±4.542)较对照组C666-1/PLVTHM (93.417±5.195)亦明显减少(t=28.569,P=0.000),提示miR-9过表达可抑制鼻咽癌细胞体外迁移能力；铺板12小时后C666-1/miR-9细胞穿透基质胶的细胞数(32.667±3.257)较对照组C666-1/PLVTHM细胞(81.833±4.366)显著减少(t=31.270,P=0.000),说明miR-9过表达可抑制鼻咽癌细胞的体外侵袭能力。背部接种C666-1/PLVTHM和C666-1/miR-9的裸鼠,2周后皮下成瘤率100%,C666-1/PLVTHM组少数瘤体因生长过快出现瘤体的表面坏死,且C666-1/PLVTHM组瘤体的平均体积(208.699±151.858)显著高于C666-1/miR-9组(128.688±75.127)(F=1472.708,P=0.000)；肝包膜下接种C666-1/PLVTHM和C666-1/miR-9细胞的裸鼠,C666-1/PLVTHM组肝内转移率88.9%(8/9)显著高于C666-1/miR-9组肝内转移率44.4%(4/9)(χ2=4.000, P=0.046), C666-1/PLVTHM组肺内转移率77.8%(7/9)显著高于C666-1/miR-9组肺内转移率22.2%(2/9)(X2=5.556,P=0.018),说明miR-9过表达能抑制鼻咽癌细胞皮下成瘤和肝肺转移的能力。4.miR-9抑制靶基因CXCR4的表达和功能生物信息学方法预测miR-9可能通过其种子序列(CUUUGGU)与CXCR4mRNA 3’-UTR的7个碱基(ACCAAAG)完全互补结合,从而发挥作用。为证实上述推测,我们构建双荧光报告质粒psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR质粒及其缺失突变体psiCHECK-2-mt-d-CXCR4 3’-UTR和替换突变体psiCHECK-2-mt-s-CXCR4 3’-UTR,并将上述载体分别与miR-9 mimics和miR-9mimics NC, miR-9 inhibitor和miR-9 inhibitor NC共转染至293FT细胞,转染48h后收集裂解细胞检测荧光素酶活性,以Firefly luciferase与Renilla luciferase的活性比值作为双荧光素酶的相对活性进行不同样品间的比较,结果示psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR与miR-9mimic共转染可显著降低荧光素酶活性(P<0.001),而将该重组质粒与miR-9 inhibitor共转染后可显著增强荧光素酶活性(P=0.001),此外,缺失突变质粒psiCHECK-2-mt-d-CXCR4 3’-UTR和替换突变质粒psiCHECK-2-mt-s-CXCR4 3’-UTR与miR-9 mimic或者miR-9 inhibitor共转染均不能改变荧光素酶的活性(P>0.05),而miR-9mimics的突变体miR-9-mt与psiCHECK-2-CXCR4 3’-UTR共转染后亦不能改变荧光素酶的活性,间接说明miR-9可通过“种子序列”与CXCRmRNA 3’-UTR区特异性结合。其次,我们构建了过表达CXCR4蛋白的真核载体pReceiver-CXCR4-ORF和pReceiver-CXCR4-ORF+3’-UTR,并将其转染至CXCR4表达水平极低的293FT细胞,48h后收集细胞并进行western blot检测,结果示两者CXCR4蛋白表达水平相当,说明CXCR4 3’-UTR作为非翻译区不影响蛋白的翻译；而niR-9 mimics与CXCR4 ORF+3’-UTR载体共转染后能显著抑制CXCR4蛋白的表达,但miR-9mimics mt(与CXCR4 3’-UTR区结合的“种子序列”发生突变)与CXCR4ORF+3’-UTR载体共转染后对CXCR4蛋白表达的抑制作用不明显,且miR-9mimics或miR-9 mimics mt与CXCR4 ORF载体共转染后均不能显著抑制CXCR4蛋白的表达,说明“丧失”CXCR4 3’-UTR区后,miR-9对CXCR4表达的调控便缺乏了关键的“桥梁”,无论miR-9分子序列是否发生突变,均不能影响CXCR4蛋白的表达,进一步证明miR-9通过与CXCR4 3’-UTR区靶向结合调控其表达;其次,我们通过慢病毒感染的方法获得稳定过表达miR9的细胞C666-1/miR-9和对照细胞C666-1/PLVTHM, Q-PCR和western-blot检测示两组细胞间CXCR4mRNA的表达水平并无显著差异(P>0.05),但C666-1/miR-9细胞CXCR4蛋白表达水平显著低于C666-1/PLVTHM细胞,而在C666-1/miR-9细胞中转染miR-9 inhibitor后CXCR4蛋白表达水平得到一定程度的“恢复”,说明miR-9通过抑制翻译而非影响转录来调控CXCR4蛋白的表达,免疫荧光结果与western-blot结果相吻合,进一步证实了上述观点。最后,为探讨miR-9能否部分逆转CXCR4在鼻咽癌中促进细胞增殖、迁移、侵袭和转移的功能,我们筛选出C666-1/CXCR4+PLVTHM与C666-1/CXCR4+miR-9细胞,结果发现C666-1/CXCR4+miR-9的增殖速度显著慢于C666-1/CXCR4+PLVTHM (F=2392.535, P=0.000), C666-1/CXCR4+miR-9形成的平板克隆数(64.90±2.29)显著少于对照组C666-1/CXCR4+PLVTHM(115.20±2.44) (t=67.185, P=0.000),说明miR-9能部分逆转CXCR4促进鼻咽癌增殖和克隆形成的作用；C666-1/CXCR4+PLVTHM与C666-1/CXCR4+miR-9的细胞凋亡状态均无显著差别；C666-1/CXCR4+miR-9细胞穿越划痕的细胞数(53.000±7.520)较对照组C666-1/CXCR4+PLVTHM(236.083±10.423)显著减少(t=49.348,P=0.000),C666-1/CXCR4+miR-9穿越transwell膜的细胞数(56.667±3.229)较对照组C666-1/CXCR4+PLVTHM(115.833±5.524)亦显著减少(t=32.033,P= 0.000), C666-1/CXCR4+miR-9穿透基质胶的细胞数(45.250±3.745)较对照组C666-1/CXCR4+PLVTHM(106.500±3.802)显著减少(t=39.760,P=0.000),说明miR-9能部分逆转CXCR4促进鼻咽癌细胞体外迁移和侵袭能力的作用。背部和肝包膜下接种C666-1/CXCR4+PLVTHM与C666-1/CXCR4+miR-9细胞的裸鼠,2周后C666-1/CXCR4+PLVTHM组皮下瘤体的平均体积(249.404±143.100)显著大于C666-1/CXCR4+miR-9组(134.357±74.782)(F=659.513,P=0.000)；C666-1/CXCR4+PLVTHM组肝内转移率100%(9/9)显著高于C666-1/CXCR4+miR-9组肝内转移率55.6%(5/9)(X2=5.143,P=0.023),而C666-1/CXCR4+PLVTHM组肺内转移率88.9%(8/9)显著高于C666-1/CXCR4+miR-9组肺内转移率33.3%(3/9)(X2=5.844,P=0.016),说明miR-9能部分逆转CXCR4促进鼻咽癌细胞皮下成瘤和肝肺转移的能力。结论1.miR-9在鼻咽癌组织和细胞中表达下调。2.鼻咽癌中miR-9表达下调与编码miR-9的基因miR-9-1, miR-9-2和miR-9-3启动子区CpG岛的甲基化有关。3.miR-9过表达能抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,miR-9在鼻咽癌中发挥抑癌作用。4.在鼻咽癌中,CXCR4为miR-9的靶基因。5.miR-9通过调控靶基因CXCR4的表达,部分逆转靶基因CXCR4在鼻咽癌中的促癌功能,从而抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。