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目的通过在体实验和离体实验,探讨PLK1和NF-?B信号通路在脓毒症肠屏障功能障碍中的作用。方法在体实验:取健康清洁成年雄性C57BL小鼠40只,采用随机数字法分为2组(n=20):正常对照组(C组)和脓毒症组(LPS组),采用腹腔内注射脂多糖(LPS)40mg/kg制备脓毒症小鼠模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。造模12h后,取小鼠静脉血,测定血清TNF-?及二胺氧化酶(DAO)水平,然后用颈椎脱臼法处死,取回盲部小肠5cm.,4%多聚甲醛固定,常规脱水石蜡包埋,切片,HE染色,观察小肠绒毛与黏膜炎症等病理改变。采用TUNEL法进行原位细胞凋亡检测。小鼠小肠PLK1表达水平检测采用Western blotting及免疫组织化学的方法。离体实验:在HT29细胞培养基中加入不同浓度(0,10,20,30?g/ml)的LPS处理24h,收集细胞行Annexin V/Propidium Iodide染色后用流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况,同时提取蛋白行Western blotting检测PARP1、Caspase3、PLK1、I?B-?等蛋白表达水平,并采用细胞免疫荧光法检测NF-?B蛋白定位;在HT29细胞培养基中加入不同浓度(0,2,10,20?ng/ml)的NF-?B通路抑制剂PDTC预处理4h,再加入LPS(30?g/ml)处理24h,收集细胞行Annexin V/Propidium Iodide染色后用流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况,同时提取蛋白行Western blotting检测Caspase3、I?B-?等蛋白表达水平;在HT29细胞培养基中加入PLK1抑制剂BI2536(50nM)处理24h,收集细胞提取蛋白行Western blotting检测PARP1、PLK1、I?B-?等蛋白表达水平,并采用细胞免疫荧光法检测NF-?B蛋白定位;在HT29细胞中正义转染pCDNA3.1-PLK1-myc质粒,再加入LPS(30?g/ml)处理24h,收集细胞用Annexin V/Propidium Iodide染色后行流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况,同时提取蛋白行Western blotting检测PARP1、Caspase3等蛋白表达水平。结果在体实验:(1)腹腔注射LPS(40mg/kg)后,与C组相比,LPS组小鼠精神萎靡、动作迟缓,腹腔内有大量脓性积液,肠管充血水肿,血清TNF-?浓度显著增加(P<0.001)。(2)与C组相比,LPS组小鼠肠黏膜明显萎缩,小肠绒毛脱落,腺体结构丧失,血清DAO浓度显著增加(P<0.001)。(3)与C组相比,LPS组小鼠肠黏膜上皮细胞发生凋亡,小肠组织中PARP1,Caspase3蛋白表达水平明显下调。(4)与C组相比,LPS组小鼠小肠组织中PLK1表达减少,I?B-?蛋白的表达水平下调。离体实验:(1)不同浓度LPS处理HT29细胞24h,可诱导细胞发生凋亡,且凋亡细胞比例随LPS浓度的增加而增大。(2)不同浓度LPS处理HT29细胞24h,与对照组相比,细胞核中NF-?B蛋白表达增加,同时I?B-?蛋白的表达水平下调。(3)用PDTC(10 ng/ml,20?ng/ml)预处理HT29细胞4h,与对照组相比,可显著减少LPS引起的HT29细胞凋亡比例(P<0.01或P<0.001)。(4)不同浓度LPS处理HT29细胞24h,与对照组相比,PLK1蛋白的表达水平下调。(5)BI2536(50nM)处理HT29细胞24h,与对照组相比,细胞核中NF-?B蛋白表达增加,同时I?B-?、PARP1蛋白的表达水平下调。(6)在HT29细胞中正义转染pCDNA3.1-PLK1-myc质粒,与未正义转染组细胞相比,LPS(30?g/ml)处理诱导细胞产生的凋亡比例显著减少(P<0.01)。结论PLK1蛋白表达下调和NF-?B通路激活在脓毒症肠黏膜屏障障碍机制中发挥重要作用;脓毒症时,PLK1通过负向调节NF-?B通路,加重肠上皮细胞凋亡,引起肠黏膜通透性增加,导致肠屏障功能障碍。