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目的：血管钙化(vascualr calcification, VC)是糖尿病(DM)常见的血管并发症,是导致DM患者心血管疾病发病率和死亡率显著增加的重要危险因素。高糖作为DM的特征性表现,是DM心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的独立危险因素。研究表明,高糖在VC的发生,发展中发挥重要作用。然而,高糖在这个过程中如何发挥作用及相应的具体机制尚不清楚。既往研究表明,高糖能够诱导血管平滑肌细胞和血管内皮周细胞发生表型转变,获得成骨样细胞表型进而形成骨基质,促进VC形成。随着研究深入,最近研究表明,内皮细胞可以通过向间充质细胞转分化(EndMT),获得多能干细胞表型,进而在一定条件诱导下成为成骨细胞参与血管中膜钙化(MAC)的形成。而且,我们在前期体内外实验中发现,糖尿病大鼠心脏微血管早期可发生EndMT,高糖可以诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)发生EndMT。因而,本研究拟在前期的研究基础上,通过体外HAECs培养,利用形态学,分子生物学等检测手段,着重探讨高糖促进内皮细胞通过EndMT向成骨细胞分化,并探讨其可能的信号传导路径,以阐明糖尿病血管钙化形成的新机制,为临床早期防治糖尿病VC提供新的思路。方法：本研究共分为两部分,第一部分实验着重探讨在高糖环境中,HAECs是否通过EndMT获得干细胞样表型,继而转化为成骨细胞沉积于血管中膜,参与血管中膜钙化的形成和进展及参与此过程的分子机制。因此,在第一部分实验中：HAECs被分成3组：正常葡萄糖浓度组(NG,5.5mM)、高浓度葡萄糖组(HG,30 mM)和等渗甘露醇组(MN,5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇),干预48小时后,Westem blot检测细胞CD31, FSP1和a-SMA蛋白的表达。免疫荧光染色,RT-PCR及Westem blot检测干细胞标志物CD44和STRO-1的表达情况。激光共聚焦显微镜观察CD31和成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)在HAECs细胞的表达共定位情况及透射电镜观察细胞形态。其后对HG刺激的HAECs予以成骨细胞诱导培养基(MODS)诱导分化1周。Westem blot检测细胞检测成骨细胞标记表达,并使用茜素红(s)染色鉴定钙质沉积,BCIP/NBT碱性磷酸酶染色；第二部分实验着重探讨IL-1β在高糖诱导的HAECs表型转变中的作用,及IL-1β产生的可能调节机制。因此,在第二部分实验中：HAECs分别予以如下干预：NG, HG,佛波酯30 nM (PKCP激活剂,PMA), PMA+LY317615 0.3 uM (PKCβ选择性抑制剂),HG+LY317615(0.3 uM), IL-1β (10 ng/ml), HG+IL-1β (10 ng/ml), HG+抗IL-1β抗体(1000 ng/ml)或HG+IL-1βsiRNA。酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-1β浓度。RT-PCR检测PKCP和IL-1β mRNA水平。Western blot检测FSP1, a-SMA,CD31及PKCβ和IL-1β蛋白表达水平。激光共聚焦显微镜观察CD31和FSP1在HAECs的共表达情况及透射电镜观察细胞形态改变。结果：第一部分实验结果显示：高糖干预后,HAECs的CD31蛋白表达减少,FSP1和a-SMA表达显著增加(P<0.05),且间充质干细胞标志物CD44、STRO-1的蛋白和mRNA表达水平呈现浓度和时间依赖性增加。免疫荧光显示间充质干细胞标志物CD44、STRO-1表达增加。另外,HG组的Notch信号蛋白亦表达增加。激光共聚焦显微镜可见CD31和FSP1表达重叠部分,部分细胞呈纺锤样改变并失去CD31染色。透射电镜可见细胞微丝成团状明显增多。经成骨细胞培养基诱导分化1周后,HG组细胞Cbfal, Osterix蛋白表达水平显著高于NG组(P<0.05)。细胞茜素红(s)染色和碱性磷酸酶染色呈现阳性。第二部分实验结果显示：与NG组比较,HG刺激HAECs导致PKCP和IL-β mRNA和蛋白表达呈浓度和时间依赖性增加。同时相应的PMA干预亦可导致HAECs表达PKCP和IL-β增加,并能够被LY317615抑制(P<0.05)。外源性IL-1β刺激可导致HAECs的FSP1和a-SMA的mRNA表达呈浓度依赖性增加(P<0.05),CD31表达减少。相较单独的HG或IL-β干预组,HG+IL-1β具有协同效应,表现为CD31表达减少(P<0.05)及FSP1和a-SMA的蛋白表达显著增加(P<0.01)。抗IL-1β抗体或IL-1β siRNA干预均可以逆转上述分子学改变(P<0.05)。同时激光共聚焦显微镜及透射电镜观察显示CD31和FSP1的共表达减弱,细胞内部微丝表达减少。结论：1)本研究表明,高糖状态下,激活的Notch信号促进内皮-间充质转分化,进而获得多能干细胞表型,并在合适的诱导环境下能够分化为成骨细胞,促进骨样物质形成。2)IL-1β介导了高糖诱导的HAECs表型的转变,而且这种转变可以通过阻断IL-1β产生而相应的减弱。3) PKCβ的激活可能是高糖状态下导致HAECs表达和分泌IL-1β升高的部分因素。因而有效的拮抗IL-1β或PKCβ通路可能为糖尿病血管病变的治疗提供了新的方向。