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马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus，MDV）之众多已得到鉴定的基因中，目前有3个基因即132-bpr、pp38、meq可能与致瘤相关。其中，meq与132-bpr两个基因是MDV-1所特有，已证实132-bpr的拷贝数与毒株的体外致弱程度有关，pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。meq基因由于具有与致瘤基因jun／fos家族类似的分子结构，因此，我们有理由认为meq基因在MDV致病、致瘤中可能发挥重要的作用。 本研究通过三个方面进行了研究，取得了如下主要实验结果： 1 MDV不同致病型（pathotypes）毒株meq基因序列的比较研究 应用PCR技术扩增了不同致病型MDVs，即国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988／Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、特超强毒648A株（vv+MDV）以及6个广西分离到的野毒株共9个毒株的meq基因，进行核苷酸序列的测定并与标准强毒GA株（vMDV）进行核苷酸和氨基酸序列的比较。结果发现，MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高；但是，与所有七个致瘤性的MDV毒株相比，二个Ⅰ型弱毒疫苗CV1988／Rispens株和814株均出现了两个特征性的突变：即第194位的P缺失性突变和第71位氨基酸由A变成了S的位点突变；缺失性突变恰恰位于meq基因中转录激活域内的一个多脯氨酸的重复序列（PPPP）之中。此外，研究还发现了meq基因的两类有趣的重复结构，其中一类是含15个氨基酸残基（EELCAQLCSTPPPPI）的结构，有2个重复，另一类是含6个氨基酸残基（PPICTP）的结构，共有4个重复，它们全部分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。 2 meq基因产物的鉴定及其细胞内表达特征的研究 源于MDV GA株的meq基因被克隆到杆状病毒转移载体质粒pBluBac4中强有力的多角体蛋白启动子(PPH)之后，经与线性化的Bac-N-Blue DNA共转 扬州大学博士学位论文三染于昆虫细胞系SFg，获得了重组杆状病毒。应用重组痘病毒表达的MEQ制备的单抗23B46对重组杆状病毒感染的SFg细胞及其裂解物分别进行间接免疫荧光试验、Westem Blot和免疫沉淀试验的检测。结果发现:本表达系统产生的MEQ蛋白可被重组痘病毒表达的MEQ制备的单抗23B46所识别;在感染细胞中，MEQ蛋白仅局限于细胞核内，而且随着感染后（PI）时间的增加，具有从核质向核仁和核膜转移的趋向;W已stem Blot和免疫沉淀试验均证实重组杆状病毒感染细胞裂解物中出现有两条大小约为60 kD的特异带。实验的结果证明杆状病毒/昆虫细胞系统用于表达外源基因可行有效。 利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系SFg上高度表达的MEQ蛋白产物免疫BALB/c小鼠，然后收获其免疫脾细胞并与肿瘤细胞系SPZ/0通过PEG于体外融合;获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 （CEF）做免疫荧光试验（FA），进行其分泌抗MEQ单克隆抗体（McAb）能力的筛选。获得4株稳定产生抗MEQ蛋白McAb的杂交瘤细胞，其中3G12E6单抗通过FA和免疫酶组化技术能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然MD肿瘤细胞中表达的me叮基因产物，而在非致瘤株CVI988/Rispens感染的CEF和免疫的正常鸡的组织中则未检测到。研究的结果首次发现，MDV致瘤株GA、RB IB感染的 cEF及自然MD肿瘤细胞中均有相当水平的meq基因产物的表达。3通过构建重组反转录病毒研究meq基因的功能 应用磷酸钙与MDv meq基因重组的反转录病毒转染栽体质粒RcAs-meq的DNA，转染于鸡胚成纤维细胞系DFI。经间接免疫荧光技木研究表明，转染后第3天即开始有少量DFI细胞在细胞核表达MEQ蛋白，以后阳性细胞增多，至转染后第7天阳性细胞最多，之后荧光即衰减;通过酶联免疫吸附试验（E LJsA）检测，发现细胞培养上清中游离病毒在转染后第5天即可检出，直至第7天仍堆持最高水平，第9天开始下降;用细胞培养上清感染DFI细胞单层，于感染后第2天即可检出MEQ蛋白阳性细胞，之后阳性细胞逐渐增多，到第4一5天达高峰，之后逐渐衰减;培养上韦平.马立克氏病病毒meq基因功能的研究清中的游离病毒在感染后第4天即可被检出，第5一7天达最高值。 利用重组反转录病毒（RCAs-meq）感染鸡胚成纤维细胞（CEF），使源于MDV强毒参考株（VMDV）GA的meq基因表达于宿主细胞内，然后再用GA株感染CEF。通过利用MDV强毒株特异的抗38kD磷蛋白（PP了8）单克隆抗体H19所进行的“黑斑”试验以确定MDV的增殖水平，并与未接种重组反转录病毒RCAS-meq的CEF进行比较。研究结果发现，细胞内表达的meq基因产物可促进GA株于体外培养细胞中的感染与增殖，导致MDV的病毒斑数显著增多。 根据上述的研究结果，证实: 首次确定MEQ蛋白的分子量为60kD左右;强毒株与弱毒株之间在meq基因的序列上存在两处有意义的特征性的差别;MEQ蛋白在MDv的宿主细胞系、非宿主细胞系以及自然MD肿瘤细胞中的表达均定位在细胞核内，而且在致瘤株中的表达量远远高于非致瘤株的:细胞内表达的meq基因产物可明显促进MDv GA株对体外培养细胞的感染及增殖。这些都符合转录激活因子的特征。 因此，我们认为meq基因在感染细胞内的表达水平是