前言脑血管疾病是目前严重威胁人类健康的疾病之一,其中缺血性疾病更占多数。脑缺血致脑细胞损伤,当恢复血液灌注后,其缺血性损伤反而进一步加重,我们称其为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury)。其发病机制涉及能量代谢障碍,细胞酸中毒,细胞内钙稳态失衡,氧化应激损伤,兴奋性氨基酸生成,炎症损伤及细胞凋亡等。这些环节彼此重叠,并相互联系,形成恶性循环。凋亡,也称程序性细胞死亡,凋亡机制在缺血性脑损伤的发生、发展中起重要作用,但其确切机制尚不清楚。脑缺血损伤后,凋亡程序的激活需要新基因的表达和某些“死亡蛋白”的合成。内源性凋亡调节基因的表达可能在决定缺血神经细胞的生死命运中起关键作用。caspase家族是一大类凋亡调节基因,其中caspase-3是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶,在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用。在神经系统中caspase-3不仅可促进脑发育时期神经元的凋亡;还可促进各种因素诱导的培养神经元的凋亡,提示caspase-3可能是缺血神经元凋亡重要效应分子。Toll样受体4(Toll like recep tors,TLR4)是与果蝇Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因编码的Toll样受体蛋白,是新近发现的先天性免疫系统中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体之一,在急性炎症反应细胞吞噬作用的调节和细胞信号转导及细胞凋亡中起重要作用。它主要介导G菌感染LPS的信号转导,最终导致NF-κB的转位与相应免疫基因的活化而转录,释放前炎症因子及辅助刺激分子(Co-stimulate moleculars),起到调节炎症反应的作用。我们研究发现,TLR4在脑缺血再灌注损伤中炎症反应中起到了非常重要的作用,TLR4很可能参与了脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡机制中的某个信号传导通路,但它如何具体参与哪项机制尚需要进一步研究。本文利用免疫组织化学、TUNEL法及Western blot方法,观察在缺血再灌注后及缺血再灌注后阻断TLR4,小鼠大脑皮质和海马两个部位的Caspase-3表达量的变化和细胞凋亡情况,探讨TLR4与小鼠脑缺血再关注损伤中细胞凋亡的关系。通过这些问题的解决,我们将进一步清楚脑缺血再灌注损伤发病的信号转导机制,为寻找新的治疗方法提供理论依据。材料和方法一、实验材料1、实验动物本研究采用中国医科大学实验动物中心提供的健康昆明小鼠90只,体重20-30g。2、主要试剂TLR4单克隆抗体(Santa Cruz公司),Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),二抗山羊抗兔多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),TUNEL检测试剂盒(Roche公司),免疫组化SP试剂盒和DAB试剂盒(迈新公司)。β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体,FITC标记的山羊抗兔二次抗体均购于北京中山公司。3、主要仪器电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机;Motic Images Advanced3.2图象分析系统;匀浆机;离心机;加样器。二、实验方法1、制备脑缺血再灌注损伤动物模型.采用夹闭双侧颈总动脉法。2、动物处理和分组动物随机分为3组,每组30只:假手术组(Sham);缺血再灌注组(I/R);TLR4抗体阻断组(TLR4)。I/R组和TLR4组采用夹闭双侧颈总动脉造成短暂前脑缺血12 min,TLR4阻断组在缺血后从右侧颈总动脉由微量注射器注入TLR4抗体(10mg/ml)。Sham组只暴露双侧颈总动脉12 min,之后再分为再灌注6h、12h、24h、48h、72h五个时间点。3、HE染色观察皮质、海马组织病理学变化。4、免疫组织化学检测各组小鼠大脑皮质和海马组织中Caspase-3的表达。5、Western blot方法检测各组小鼠大脑皮质和海马组织中Caspase-3的表达。6、TUNEL法原位检测各组小鼠大脑皮质和海马组织中的细胞凋亡情况。7、图象分析HE染色切片图像分析,并进行神经病理损伤评分。Western blot结果用ChemiImager5500V2.03软件扫描,用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的IDV值。免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。TUNEL法原位检测细胞凋亡结果在高倍显微镜下测定海马区5视野凋亡细胞的平均凋亡率。8、统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较进行单因素方差分析。实验结果1、组织病理学观察结果及神经病理损伤评分结果HE染色可见假手术组皮质和海马细胞形态正常,细胞排列整齐、形态完整;缺血再灌注组细胞排列散乱,有的胞浆空泡形成,有的神经元肿胀、分布不均、核固缩深染、核仁消失;TLR4阻断组神经元胞体肿胀明显减轻,细胞形态明显改善。假手术组皮质和海马神经元在各再灌注时间点神经病理损伤评分均较低;TLR4阻断组和缺血再灌注组的神经病理损伤评分均有不同程度的增高,两组与假手术组比较差异有显著性(P＜0.05)。TLR4阻断组在各再灌注时间点神经病理损伤评分均低于缺血再灌注组(P＜0.05)。2、Caspase-3在皮质的表达和TUNEL皮质细胞凋亡检测结果免疫组织化学结果显示:在相同时间点,缺血再灌注组大脑皮质部Caspase-3阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于假手术组(P＜0.05);而TLR4阻断组与缺血再灌注组相比,大脑皮质部Caspase-3阳性反应产物的平均光密度值明显降低(P＜0.05)。Western blot结果显示:在相同时间点,与假手术组比较,缺血再灌注组小鼠大脑皮质部Caspase-3目标带的IDV(integrated density value)与内参照IDV的比值均明显升高(P＜0.05),而TLR4阻断组上述部位样品中Caspase-3目标带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于缺血再灌注组(P＜0.05)。TUNEL细胞凋亡检测结果显示:在相同时间点,缺血再灌注组大脑皮质部凋亡细胞较假手术组高,TLR4阻断组大脑皮质部凋亡细胞较缺血再灌注组减少(p＜0.05)。3、Caspase-3在海马的表达和TUNEL细胞凋亡检测结果免疫组织化学结果显示:在相同时间点,缺血再灌注组大脑海马部Caspase-3阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于假手术组(P＜0.05);而TLR4阻断组与缺血再灌注组相比,大脑海马部Caspase-3阳性反应产物的平均光密度值明显降低(P＜0.05)。Western blot结果显示:在相同时间点,与假手术组比较,缺血再灌注组小鼠大脑海马部Caspase-3目标带的IDV(integrated density value)与内参照IDV的比值均明显升高(P＜0.05),而TLR4阻断组上述部位样品中Caspase-3目标带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于缺血再灌注组(P＜0.05)。TUNEL细胞凋亡检测结果显示:在相同时间点,缺血再灌注组大脑海马部凋亡细胞较假手术组高,TLR4阻断组大脑海马部凋亡细胞较缺血再灌注组减少(p＜0.05)。讨论新近发现的TLRs是一类模式识别受体,广泛分布于免疫细胞表面,而1997年Janeway、Medazhitov和Rock等首次发现与果蝇Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其编码的Toll样受体蛋白,即如今的TLR4蛋白,已成为人类在各种疾病中研究的热点。Lehnardt S等在中枢神经系统证实神经元的退行性病变与TLR4信号转导途径有关,高音等研究发现在小鼠脑缺血再灌注损伤中TLR4介导的MyD88信号通路参与了炎症反应的发生。而在脑缺血再灌注损伤中不仅涉炎症反应,同时还发生细胞凋亡反应。因此,也有可能TLR4也参与了脑缺血再灌注凋亡反应机制。虽然目前对凋亡的调控机制还不清楚,但肯定的是蛋白水解酶家族、Fas、bcl-2家族等在其中发挥了重要作用。其共同的特征是蛋白水解酶的活化,而该过程的核心就是Caspase-3的活化,通过对Caspase-3的检测可以了解细胞凋亡的程度和时间。实验结果表明,在免疫组织化学染色中,皮质和海马区Caspase-3蛋白在缺血再灌注组表达明显高于假手术组,并且随着再灌注时间的延长表达增多,在再灌注48h达高峰,而TLR4阻断组在各时间点明显低于缺血再灌注组。Western Blotting结果显示,Caspase-3蛋白表达变化同免疫组化结果一致。提示TLR4上调小鼠缺血再灌注损伤中大脑皮质和海马神经细胞Caspase-3蛋白表达。通过对皮质和海马区的原位细胞凋亡检测,观察到凋亡细胞缺血再灌注组明显多于假手术组,而TLR4阻断组较缺血再灌注组明显减少,提示TLR4可能影响了小鼠缺血再灌注损伤中大脑的皮质和海马区的细胞凋亡。刘天会等研究表明,Caspase-3在脑缺血再灌注中的细胞凋亡中起到了非常重要的作用。因此,阻断TLR4,会减轻小鼠脑缺血再灌注损伤中大脑神经细胞的凋亡,但是,TLR4通过那些途径来作用于细胞凋亡程序还有待进一步研究。脑缺血是临床上的常见疾病,而恢复对缺血区的再灌注是必要的治疗措施。而本试验为减轻再灌注带来的损伤,减少神经细胞的死亡,提供了参考依据,为脑缺血疾病的治疗提供新的治疗途径。结论缺血再灌注组小鼠大脑皮质和海马部位Caspase-3表达量和神经细胞凋亡明显增多,TLR4阻断后,明显减少,提示TLR4参与了小鼠脑缺血再灌注损伤中大脑皮质和海马区的神经细胞凋亡。