抗生素的不合理使用导致细菌耐药性日趋严峻,严重威胁人类和动物健康,寻找有效对抗耐药细菌的新手段迫在眉睫。新型抗生素的研发进展缓慢,无法满足临床治疗的需求。在寻找抗生素的替代方案中,噬菌体是目前最受人关注的目标之一。在应用过程中研究人员发现,针对单株病原菌筛选单一天然噬菌体的传统模式,适用于个体感染,但是对于集约化养殖的畜禽群体防治效果不好,无法应对流行菌株的变异性,而且有大量的病原菌无法筛选到裂解性噬菌体。在天然噬菌体资源的基础之上,通过合成生物学技术,构建高效安全的非天然噬菌体成为该领域的重要研究方向。遗传密码子扩展是合成生物学领域的新技术,它可以重定义密码子功能,将非天然氨基酸插入到蛋白质的选定位点,赋予蛋白新的特性。通过在噬菌体关键蛋白中引入非天然氨基酸,赋予该蛋白质新的性质,构造出抗菌谱更广和裂菌效率更高的噬菌体,从原理上具有先进性。通过遗传密码子扩展技术,构建包含非天然氨基酸的噬菌体,首先需要对噬菌体基因序列进行体外编辑,最有效的途径是构建噬菌体质粒,在大肠杆菌或酵母里实现噬菌体基因组的人工改造,然后在相应的宿主细菌里进行噬菌体拯救,所以本课题利用DNA同源重组工程对噬菌体质粒构建、编辑和拯救技术进行了研究。我们以大肠杆菌Lambda噬菌体为模式系统,利用ExoCET直接克隆技术在大肠杆菌工程菌中抓取了 Lambda噬菌体完整的基因组,然后用Red重组技术结合ccdB反向筛选进行无痕修饰,添加了一个AfⅢ酶切位点,作为基因工程拯救噬菌体的遗传标记,将修饰后的Lambda噬菌体质粒电转宿主菌并成功拯救出噬菌斑。基于Lambda噬菌体直接克隆修饰后可成功拯救,本课题又对其进行了一系列定向改造。首先我们将Lambda噬菌体基因组上仅有的四个终止密码子TAG突变成TGA,这样在不含有TAG终止密码子的Lambda噬菌体基因组中,可以用TAG编码一个新的非天然氨基酸。同时,在Lambda的非必需区B2位点引入了荧光报告基因mNeonGreen,便于检测和评估TAG编码的非天然氨基酸插入Lambda噬菌体的特异性和效率。由于mNeonGreen插入后成功表达且不影响Lambda噬菌体裂解增殖,我们选择将其42位的天冬氨酸密码子GAT突变成TAG进行后续的实验。噬菌体基因组编辑困难,是基因组结构解析和功能研究的瓶颈,同时也限制了通过遗传改造提升噬菌体杀菌性能的潜力。本研究以温和型Lambda噬菌体为研究对象,利用DNA同源重组工程,结合CRISPR-Cas技术,开发高效的噬菌体基因编辑技术。我们首先在大肠杆菌中将DNA同源重组工程与CRISPR-Cas3系统相结合进行效率比较,结果发现重组酶Redαβ与Cas3蛋白共表达后重组效率最高。我们分别进行噬菌体侵染重组实验和电穿孔噬菌体DNA重组实验,检测Redαβ结合Cas3后能否同样提高重组效率,选择最优重组实验方式。结果表明,表达Cas3后突变噬菌体占比高的噬菌斑数量明显增多,表明Cas3可以通过大量切除野生型噬菌体提高重组效率,并且电穿孔噬菌体DNA重组实验编辑效率要高于噬菌体侵染重组实验。稳定高效表达异源蛋白,需要将异源DNA精确插入工程细胞系具有良好特征的基因组位点。为了 CHO细胞稳定高效地生产外源蛋白,本研究拟利用重组酶介导的盒式交换技术（recombinase-mediated cassette exchange,RMCE）技术构建了 CHO-K1Q 稳定表达体系。根据小鼠转基因经验,我们选择了两个转基因表达位点Hprt和Rosa26,在选定位点利用CRISPR/Cas9辅助的同源重组插入由Cre重组酶识别位点等构成“着陆点”（landing pad,LP）,成功建立了两个起始细胞系。这样就能够通过RMCE在特定位点上快速、精确地插入外源基因表达盒,从而实现外源基因的表达。由于转基因表达水平高度依赖于含有开放染色质的位点和异源启动子的组合,我们构建了一系列不同启动子驱动mNeonGreen报告基因的RMCE质粒,后续通过RMCE插入到表达位点上,通过比较荧光强度及mRNA水平,筛选最优的靶位点和启动子组合,构建出大规模生产目标蛋白的CHO细胞稳定表达系统。