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研究背景抗病毒治疗是慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)治疗的关键。目前应用于抗病毒治疗的药物主要分为两大类：核苷(酸)类似物和干扰素。拉米夫定(LAM, lamivudine)是第一个被批准用于慢性乙型病毒性肝炎治疗的药物,它能够有效的抑制乙型肝炎病毒的复制,可以显著的降低血清中HBV DNA (hepatitis B virus DNA)的水平,促进HBeAg (hepatitis B e antigen)的血清学转换,改善肝脏的炎症活动,延缓或阻止肝脏疾病的进展,降低肝癌(HCC, Hepatocellular carcinoma)的发生率。由于其相对较低的价格,拉米夫定仍然是很多病人进行抗病毒治疗的首选药物,特别是在发展中国家。但是长期治疗过程中产生耐药是抗病毒治疗的一个难题。拉米夫定治疗一年的基因耐药率是14-32%,治疗2年、3年和4年后分别上升到38%、49%和66%。有些病人在出现病毒学突破后发生肝炎的急性恶化,导致肝脏失代偿,甚至是死亡。耐药后继续拉米夫定的治疗将不能获得临床益处。拉米夫定耐药性的产生主要与HBV P基因逆转录(RT)酶区突变有关,这些突变位点大部分位于204位点即YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)基因序列,YMDD基因序列位于DNA聚合酶中心部位,是酶的催化区,与核苷酸的亲和力高,主要的改变是YMDD中M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)成为YVDD(rtM204V)或是YMDD中的M(蛋氨酸)被I(异亮氨酸)取代,成为YIDD(rtM204I)也有少部分位于180位点L(亮氨酸)变为M(蛋氨酸)。另外还有相关研究表明,YMDD变异还会影响其他核苷(酸)类似物的药效,因为有共同的耐药位点的缘故,还有可能会引起其他抗病毒药物(如恩替卡韦)的耐药,对于已经发生了rtM204V/I变异的患者,我们应该谨慎的选择治疗方案。YMDD变异的产生使得HBV DNA聚合酶的活性降低,所以新产生的突变的准种的复制能力低于野生株,属于非优势株,但是随着抗病毒药物的应用,在抗病毒药物及机体免疫力的作用下野生株即优势株的的复制能力逐渐被抗病毒药物抑制,复制能力降低,野生株的数量逐渐减少甚至消失,剩余的变异的突变株转为优势株,但是因为这种变异株的聚合酶区发生突变,拉米夫定对这种变异株的复制没有抑制作用,变异的病毒开始继续复制,随着复制的进行,逐渐占主导地位,使患者体内的病毒数量激增,导致患者HBV-DNA和ALT的水平出现反弹。因此YMDD变异的快速检测对于及早发现耐药变异、避免耐药的发生、对患者实施个体化治疗方案具有重要意义。目前用于临床耐药检测的方法有很多种,PCR产物直接测序法(direct PCR sequencing), PCR产物克隆测序法,聚合酶-限制性片段长度多态性,反向杂交法(reverse hybridization assay),基因芯片(gene chip),限制片段质谱多态性技术(restriction fragment mass polymorphism,RFMP)等,目前被大家公认的耐药检测的是PCR产物直接测序法,Keefffe等认为PCR产物直接测序法应作为基因型耐药检测的金标准。但是该方法的灵敏度低,最低检测限为20%,即突变株数量需达到整个病毒群的20%时,才能检测到。因为存在这种缺陷,所以不能尽早发现病人的耐药突变,所以需要一种灵敏性及特异性高的方法来及早发现突变来治疗病人的临床用药。PNA(peptide nucleic acid,PNA)即肽核酸是于1991年由哥本哈根大学的Riso实验室的丹麦科学家Nielsen等首先设计合成。PNA的骨架由重复排列的N-(2-氨乙基)甘氨酸单位通过酰胺键连接而成,嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接于骨架的氨基N上,由于不含有磷酸基团,故不带电,为中性,与靶序列杂交时排斥力很小,形成的复合物非常稳定。PNA的特性主要包括一下几方面：1、PNA与DNA单链或RNA杂交体(PNA/DNA)的稳定性较高：与相应DNA双链相比,每增加一个碱基对,PNA/DNA解链的Tm值将增加1℃(O.lmol/l的NaCl中)。例如,一15碱基对DNA双链的解链温度为54℃,相应PNA/DNA的解链温度就达到69℃。2、复合物的稳定性不受盐浓度的影响：PNA/DNA杂交形成的双螺旋结构的稳定性与介质的盐浓度无关。在盐离子强度较低时,PNA能与靶序列的单链DNA分子杂交,形成稳定的复合物并且复合物的Tm值较高。PNA/DNA、PNA/RNA的结合比相应DNA/DNA、DNA/RNA的结合更稳定,这是由PNA和DNA链之间缺乏静电排斥所致。在低离子强度环境下,特别是在无Mg2+环境中,PNA也能与DNA杂交。利用这一特性,可通过适当调整介质的离子浓度设计PNA探针,与标本中的DNA或PNA杂交,这一应用主要是用于靶序列中点突变的检测。3、PNA与互补DNA杂交结合时有很高的专一性,PNA/DNA碱基错配杂交分子的不稳定性比DNA/DNA碱基错配杂交分子的不稳定性更高。例如：在混合的PNA/DNA杂交分子中,如果15个碱基对中有一对错配,则其解链温度(Tm)下降8-20℃(平均降低15℃),两对碱基错配则完全不能杂交,而相应的DNA/DNA杂交分子中,一个碱基对配错,解链温度只降低4-16℃,(平均降度11℃)。因此,与DNA探针相比,较短的PNA探针可以进一步提高探针杂交的专一性。本研究正是利用PNA的这些特性,设计出针对HBV YMDD野生株的PNA探针。PNA探针与靶DNA单链结合后稳定性高,且解链温度高。如果在PCR反应中加入PNA探针,YMDD野生株DNA/PNA杂交体由于完全配对而具有较高的解链温度；而变异株的DNA/PNA杂交体由于存在一个碱基的不配对而具有较低解链温度。设计PCR的复性温度高于变异株DNA/PNA杂交体的解链温度,而高于野生株DNA/PNA杂交体的解链温度；就能抑制YMDD野生株的扩增,从而选择性的扩增变异株。实验目的1.本研究拟建立一种更加灵敏的检测HBV YMDD突变的方法-PNA-PCR法,通过该方法检测已知病毒含量的不同比例混合的质粒的突变,与直接测序法相比较,验证新方法的灵敏性及特异性。2.通过对临床核苷类药物治疗的病人耐药检测以及未治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者预存耐药的检测,验证新方法在抗病毒治疗过程中耐药检测的优势。材料与方法1.样本来源：选用100例南方医院2011年3-5月门诊测序病人的标本,上述患者均接受拉米夫定治疗且临床怀疑或检测耐药,另外收集100例南方医院感染内科门诊2012年7月-11月未使用核苷(酸)类药物治疗的患者血清,及20例健康献血者的血清,上述患者HBeAg阳性或阴性,无HIV,HCV,HDV等感染史,收集所有患者血清,储存于-30℃。2. HBV DNA提取：收集患者血清,使用凯杰公司的QIAamp DNA Blood MiniKit,根据操作说明从200μl血清中提取HBV DNA用于下一步操作。3. HBV DNA逆转录酶区(Reverse Transcriptase region, RT)扩增：分别使用直接测序法及PNA-PCR法对HBV RT区进行扩增,直接测序法的产物送测序,PNA-PCR法的结果直接是用琼脂糖凝胶电泳法来观察。4,。统计学分析：所有的数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析,率的比较用χ2检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.新的耐药检测的方法PNA-PCR法的灵敏性及特异性与临床常规测序方法的比较评价：在病毒含量较低的情况下,直接测序法只能检测到10%的突变,而PNA-PCR法则可以检测到0.01%的突变,检测的灵敏性提高1000倍；在病毒含量较高的情况下,直接测序法可以检测到0.01%的突变,PNA-PCR法可以检测到0.001%的突变,检测的灵敏性提高10倍。总之,直接测序法相比PNA-PCR法可以将耐药突变检测的灵敏性提高10～1000倍。2. PNA-PCR法在临床耐药检测中的应用：.(1).使用核苷(酸)类似物治疗的患者HBV YMDD耐药的检测：在100例患者中有15例患者结果为PCR阴性,剩余85例患者用直接测序法检测突变的结果为34例(YIDD为21例,YVDD为11例,YIDD+YVDD为2例),阳性率为40.0%。PNA-PCR法检测突变结果为73例(YIDD为40例,YVDD为23例,YIDD+YVDD为10例),阳性率为85.9%,较直接测序法检测的灵敏度大幅度提高。(2)未使用核苷(酸)类似物治疗的患者HBV YMDD耐药检测：在100例未经核苷(酸)类似物治疗的患者中有21例患者使用PNA-PCR法检测出存在YMDD自然突变阳性率为21%,20例健康献血者的血清分别使用PNA-PCR法及PCR产物直接测序法检验,均未检测到乙肝病毒,两种方法的特异性好,未出现假阳性。结论1、PNA-PCR法在检测乙肝病毒YMDD耐药突变种具有较高的灵敏性及特异性,尤其是在血清低病毒拷贝是,与直接测序法相比,PNA-PCR法具有更高的灵敏性,检测差异明显；2、PNA-PCR PNA-PCR法可以检测出万分之一的rtM204I或rtM204V耐药突变株,从而可以提前监测到耐药准种的发生,为临床抗病毒治疗中耐药准种的发生提供重要指标。3、未经治疗的HBV感染的患者体内存在YMDD的自然变异株,但是耐药突变株的存在对于以后患者以后能否使用拉米夫定治疗,还需要进一步研究。