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诱导多能性干细胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)与胚胎干细胞（embryonic stemcells，ESCs）极为相似，不仅可以自我更新（self-renewal），也具有分化为几乎所有类型细胞的潜能，在医学、畜牧学和生物学基础研究等方面应用前景广泛。然而，诱导效率低下、安全性不明确、质量不高等仍困扰着iPSCs的快速发展。猪既是一类有重要经济价值的农业动物，也是一种理想的模式生物。虽然人们对猪ESCs的分离、培养与鉴定等进行了许多有益探索，但是至今仍未得到真正意义上的猪ESCs，猪ESCs的培养体系、鉴定标准等有待完善。人们先后利用多种诱导体系、不同载体系统和源头细胞获得猪iPSCs，这不仅可以作为猪ESCs的有益补充，也有助于猪ESCs的进一步发展。遗憾地是，猪iPSCs的诱导效率低、质量差，尤其是生殖系传递能力不理想，基于猪iPSCs制备嵌合体猪、克隆猪仍面临巨大挑战。已知外源基因随机整合、iPSCs诱导培养体系不理想等均影响iPSCs的诱导效率和质量。本研究利用Tet-On慢病毒诱导系统，在诱导过程中分别添加维生素C（vitamin C,Vc）和CHIR-99021优化猪体细胞重编程诱导体系，并尝试构建出携带信号穿膜肽的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Lin28等多能性转录因子真核表达载体，获取转基因细胞系，为制备真核重组蛋白，开展基于非基因组整合策略的重组蛋白诱导猪iPSCs提供素材。 试验一：利用小分子化合物Vc、CHIR-99021优化猪源头体细胞的诱导重编程。以猪脂肪干细胞、成年猪耳缘皮肤成纤维细胞、新生仔猪耳缘皮肤成纤维细胞及猪胎儿成纤维细胞等为源头细胞，采用携带转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的Tet-On慢病毒诱导系统进行处理。在诱导过程中分别添加Vc和/或CHIR-99021，通过计算碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）染色的阳性克隆数，比较猪体细胞重编程效率。结果表明，添加Vc和CHIR-99021显著提高了猪不同类型体细胞重编程效率(P<0.05)。另外，比较不同源头细胞的供体年龄和猪不同类型体细胞的重编程效率，结果显示不同源头细胞供体年龄对重编程效率影响不明显(P>0.05)，而猪不同类型的体细胞对重编程效率影响有显著差异(P<0.05)。通过检测猪脂肪干细胞诱导不同时期部分基因表达情况，揭示了猪脂肪干细胞重编程过程中部分基因表达变化趋势。 试验二：真核表达转录因子 Oct4-9R、Sox2-9R、Klf4-9R、c-Myc-9R以及 Lin28-9R转基因载体构建和转基因细胞系建立。提取猪囊胚、猪iPSCs总RNA，反转录成cDNA后，PCR扩增出Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Lin28。改造骨架载体pEGFP-N1后，加入目的基因，构建出真核表达载体。利用FuGENE?HD转染293T细胞系，经嘌呤霉素筛选7天后，获得稳定表达Oct4-9R、Sox2-9R、Klf4-9R、c-Myc-9R、Lin28-9R以及DsRED-9R的293T细胞系。利用DsRED-9R蛋白处理猪胎儿成纤维细胞新生仔猪耳缘成纤维细胞和鼠胎儿成纤维细胞，8h后，DsRED-9R能进入细胞胞质和细胞核中，证明了9R具有携带目的蛋白进入细胞质和细胞核的能力。 总之，我们发现适当浓度小分子Vc和CHIR-99021处理可以提高猪体细胞重编程效率，并通过定量PCR方法揭示了猪脂肪干细胞在重编程过程中部分基因表达变化趋势；成功构建出携带细胞穿膜肽的Oct4-9R、Sox2-9R、Klf4-9R、c-Myc-9R以及Lin28-9R等转录因子真核转基因载体，获得了转基因种子细胞，并证实了细胞穿膜肽可以携带报告蛋白进入细胞核，为今后开展重组蛋白诱导系统，获得非基因组整合的猪iPSCs奠定了基础。