乳腺炎是危害乳业最严重的疾病之一,在世界范围内可造成巨大的经济损失。金黄色葡萄球菌是诱发奶牛乳腺炎常见的病原菌之一。目前临床上主要应用抗生素来治疗乳腺炎,但抗生素长期滥用导致金黄色葡萄球菌耐药性不断增强。因此,迫切需要寻找防治金黄色葡萄球菌感染的替代策略。金黄色葡萄球菌具有很强的生物膜形成能力,其定植及毒力产生大部分依赖于其群体感应系统和生物膜的形成。细菌生物膜被认为是金黄色葡萄球菌持续感染存在的重要原因。因此,针对金黄色葡萄球菌生物被膜开发抗生物膜药物,已成为解决金黄色葡萄球菌感染和耐药问题的研究方向之一。芽孢杆菌是一类潜在的益生菌,广泛存在于环境之中,可以定植于肠道。不同的芽孢杆菌菌株在宿主体内表现出抗菌、抗氧化和免疫调节活性。另外,通过抑制细菌生物膜来清除病原体是芽孢杆菌菌株的另一个潜在属性。有文献报导,芽孢杆菌可抑制金黄色葡萄球菌的群体感应系统,从而减少金黄色葡萄球菌在肠道定植。那么芽孢杆菌是否可以通过抑制金黄色葡萄球菌在乳腺的定植从而缓解金黄色葡萄球菌性乳腺炎。因此,在本研究中,我们探究了乳腺共生芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用及机制。为预防金黄色葡萄球菌性乳腺炎提供思路,同时为乳腺炎的治疗探寻更加健康有效的途径。首先,我们对吉林省白城市、内蒙古赤峰市和山东省潍坊市养殖场健康奶牛和患有乳腺炎奶牛的乳汁进行采样,通过对牛奶样品进行平板涂布分离培养细菌,分析不同来源牛奶样品中金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌定植差异。结果发现,芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌在奶牛乳腺中的定植呈负相关关系。其次,在体外分析芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的影响。通过抑菌效果检测;细菌生物膜总量测定;金黄色葡萄球菌菌落计数以及调控生物膜形成相关基因检测,进一步探究了芽孢杆菌具体通过什么途径影响金黄色葡萄球菌在乳腺的定植,同时分离筛选出具有优良性能的芽孢杆菌。结果发现,芽孢杆菌不影响金黄色葡萄球菌的生长,但是抑制了金黄色葡萄球菌生物膜的形成。针对这一现象,我们对从牛奶样品中分离出的145株芽孢杆菌进行了抗金黄色葡萄球菌生物膜能力检测,最终筛选发现B.subtilis H28具有显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成作用。通过结晶紫染色以及RT-PCR检测,结果显示,B.subtilis H28以剂量依赖的方式抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,这与B.subtilis H28可以抑制生物膜形成相关基因Agr A、RNAIII、ica的基因表达相关。最后,建立金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎模型和金黄色葡萄球菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞炎症模型。在上述模型中加入B.subtilis H28,通过组织病理学观察;TNF-α和IL-1β炎性细胞因子分析;MPO活性检测;紧密连接蛋白的表达变化;乳腺内金黄的葡萄球菌载量的检测以及金黄色葡萄球菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞炎症模型中NF-κB信号转导通路下游核因子变化以及生物膜形成相关基因表达变化分析,验证B.subtilis H28是否能对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎有保护作用,并初步探究其机制。结果表明,B.subtilis H28可以显著缓解金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎,表现为可以减轻金黄色葡萄球菌引起的乳腺病理损伤,减少炎性细胞浸润;抑制促炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的产生;降低MPO活性;增强血乳屏障的完整性;并减少乳腺中金黄色葡萄球菌的载量。此外,B.subtilis H28可以通过剂量依赖性的方式抑制金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺上皮细胞NF-κB信号的激活,并降低TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL3 m RNA水平。同时,我们发现B.subtilis H28降低了与生物膜形成相关基因ica、RNAIII和Sar A的表达,从而抑制了金黄色葡萄球菌生物膜的形成。综上所述,共生芽孢杆菌通过抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成来减少金黄色葡萄球菌在乳腺的定植、降低NF-κB信号的激活最终缓解金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎症,以上结果表明,干扰病原体金黄色葡萄球菌生物膜形成的B.subtilis H28可以作为一种潜在和有效的策略来治疗金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎及相关疾病。