论文部分内容阅读
油桐(Vernicia fordii)是原产中国的世界著名工业油料树种,由其种子提炼而得的桐油是一种优质干性油,广泛用于工、农、渔、军事及医药等领域,同时因其清洁、安全、可再生等特点可作为重要的生物柴油原料。1939年以来,油桐枯萎病的爆发使大片油桐林被毁,严重制约了油桐的种植及产业发展,且该病在2007年卷土重来,再次让我国油桐产业蒙受损失。油桐枯萎病发病历时长、分布广、危害重、损失大,多年来难以从根本上进行有效防治,从分子水平对油桐枯萎病抗性相关基因的挖掘有助于对油桐抗枯萎病机理进行解析。油桐枯萎病主要侵害三年桐,而同属的千年桐具有抗枯萎病能力。本文将油桐枯萎病病原菌[尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)]侵染感病三年桐和抗病千年桐,对侵染前后不同时期的根部组织进行RNA-seq测序,分析两个物种响应油桐枯萎病的基因表达模式及差异,发现富亮氨酸重复类受体蛋白(Leucine-rich repeat receptor-like protein,LRR-RLK)基因家族在抗病千年桐中作为中心基因参与千年桐对枯萎病的应答。我们对两个树种的LRR-RLK基因家族着重进行了比较分析。主要研究结果如下:(1)尖孢镰刀菌侵染三年桐根部不同时期转录组测序。得到258,435条转录本、133,304个gene。通过BLAST程序与公共数据库进行比对注释,分别有63.41%、56.68%和40.66%的基因比对到NR数据库、KOG数据库和GO数据库。34.00%的基因比对到KEGG数据库的1,021个酶和279个通路中。对尖孢镰刀菌侵染不同时期的三年桐根部差异表达基因分析发现,未侵染到侵染前期(F0-F1)的显著差异表达基因(|log2foldchange|>=1,P<0.05)最多,对其进行GO分类富集,主要聚集于ATP结合、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和DNA结合。(2)尖孢镰刀菌侵染千年桐根部不同时期的比较转录组测序。得到245,240条转录本、111,278个gene。通过BLAST程序与公共数据库进行比对注释,分别有70.26%、58.53%、39.06%的基因比对到NR数据库、KOG数据库和GO数据库。67.43%的基因比对到KEGG数据库的956个酶和278个通路中。对尖孢镰刀菌侵染不同时期的千年桐根部差异表达基因分析发现,未侵染到侵染中期(m0-m2)的显著差异表达基因最多,对其进行go富集,主要聚集于atp结合、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和受体活性。(3)尖孢镰刀菌侵染前后三年桐和千年桐根部比较转录组学分析。三年桐对尖孢镰刀菌侵染的响应主要是在侵染前期(f0-f1),差异表达基因以下调为主;而千年桐则持续到侵染中期(m0-m2),以上调为主。千年桐中显著差异基因更多聚集在防卫反应、多细胞的细胞壁组织、碳水化合物的代谢过程和蛋白质水解。在三年桐(57.60%,44,310/76,924)、千年桐(72.83%,44,310/60,842)中发现了44,310对直系同源基因。对三年桐、千年桐根部响应尖孢镰刀菌的基因表达方式进行k-means聚类,发现绝大多数直系同源基因表现出相同的表达模式,少数基因表达模式不同。对表达模式在两个物种中不一致的30对基因进行了qrt-pcr验证,结果与rna-seq基本一致(81.7%,49/60)。对两个物种中差异表达基因的相关性进一步分析,发现450对基因在两个物种中呈显著正相关和负相关(相关系数r>0.65orr<-0.65,p<0.05)。其go富集在防卫反应、茉莉酸、水杨酸等相关通路。对抗病千年桐的基因共表达网络分析发现,富亮氨酸重复类受体蛋白lrr-rlk、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶d6pk为中心基因,介导的抗枯萎病反应主要涉及mapk信号通路、植物与病原菌互作、昼夜节律、钙信号通路。(4)进一步对三年桐、千年桐lrr-rlks进行初步分析。在三年桐、千年桐中分别找到230和236个lrr-rlks。vf/vmlrr-rlks的rlk结构域比lrr结构域更为保守,以rlk结构域氨基酸序列多序列比对结果构建vf/vmlrr-rlks系统发育进化树,进化树被分为16支。vf/vmlrr-rlks中,lrr结构域典型的保守基序为lxxlxlxxnxlxgxipxxlxxw/lxx,与前人总结的植物vf/vmlrr-rlks基因中lrr结构域的保守基序lxxlxlxxnxlxgxipxxlxxlxx极为相似,仅在倒数第三个氨基酸的位置会有所差异(除了“l”外,还会出现“w”)。绝大多数vf/vmlrr-rlks直系同源基因对尖孢镰刀菌侵染表现出相同的表达模式,少数基因不同。进一步的组织表达特异性分析结果显示,对尖孢镰刀菌侵染表现出不同表达模式的vflrr-rlk256、vmlrr-rlk206分别在三年桐种仁中和千年桐根中高表达。(5)通过rt-pcr方法克隆了全长678bp的vflrr-rlk1基因,成功构建了植物表达载体vflrr-rlk1-pbi121,并将其转化至根癌农杆菌eha105,通过蘸花侵染法侵染突变体拟南芥植株、经过抗性筛选、PCR鉴定,最终获得了阳性转基因植株,为VfLRR-RLK1-p BI121基因后期的功能鉴定奠定了基础。