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目的:体外诱导NSCs并使NSCs分化为NPCs,观察NSCs及NPCs在发育过程中NMDARs(NMDA受体)介导的全细胞电流的变化情况,以及Na+、Ca2+电流出现的先后顺序,为作用于NMDARs促进NSCs分化为NPCs的药物提供一定的实验依据。
方法:应用细胞免疫化学方法观察神经干细胞Nestin以及分化1d、3d、7d、9dNPCs的βⅢ-tubulin表达情况。应用全细胞膜片钳技术在-60mv钳制电压下记录NSCs和NPCs电流。将NSCs和NPCs和分为对照组和实验组观察NSCs的NMDARs介导的电流变化以及NPCs分化1d、3d、5d、7d、9d时NMDARs介导的电流变化。对照组加入无Mg2+的配制20μM CNQX(AMPA和KA受体阻断剂)冲洗细胞20s后立即加入无Mg2+的细胞外液;实验组先加入用无Mg2+细胞外液配制20μM CNQX(AMPA和KA受体阻断剂)冲洗细胞20s后立即加入用无Mg2+细胞外液配制的10μM、20μM、50μM、100μMNMDA,观察NMDARs介导电流的变化情况。当观察Na+、Ca2+电流出现的先后顺序时,(A)全电流组:先加入用无Mg2+细胞外液配制的20μMCNQX冲洗20s后立即加入用无Mg2+细胞外液配制100μMNMDA;(B)无Na+组:先用无Mg2+的NMDG(替代等摩尔量的Na+)细胞外液配制的20uMCNQX冲洗细胞20s后立即加入无Mg2+的NMDG细胞外液配制的100μMNMDA;(C)无Ca2+组,先用无Mg2+的EGTA(螯合细胞外液的Ca2+)细胞外液配制的20μMCNQX冲洗细胞20s后,加入无Mg2+的EGTA细胞外液配制的100μMNMDA;(D)无Na+、Ca2+组,先用无Mg2+的无Na+、无Ca2+细胞外液配制的CNQX20μM冲洗细胞20S,后加入用无Mg2+的无Na、无Ca2+细胞外液配制的100μM NMDA,观察电流变化。
结果:1.免疫细胸化学方法观察到NSCs的Nesting为阳性,1d、7d、9d的NPSs的βⅢ-tubulin为阳性。
2.未检测到NSCs的NMDARs介导电流产生3.在不同分化时间的NPCs中,分化1d和2d的NPCs未检测到电流。
3.分化3d、5d、7d、9d的NPCs时对照组未检测到电流,实验组检测到电流,分化相同天数的NPCs随剂量增加电流增大,p<0.05;加入相同、剂量的NMDA,随着时间的进行电流增大,p<0.05。
4.检测分化3dNPCs的NMDARs介导电流由离子Na+内流产生。
结论:1.NSCs的NMDARs不能介导电流产生;NPCs的NMDARs第3天可介导产生电流。
2.分化3d、5d、7d、9d的NPCs的NMDARs介导产生电流随着NMDA剂量的增加而增加;随着发育天数的增加,加入相同剂量的NMDA诱导NMDARs介导产生的电流也随之增加。
3.发育第3d时NMDARs首先介导Na+产生电流。