目的:慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）,简称慢阻肺,是一种复杂和异质性疾病,其异质性在于不是所有机制都同时出现在同一患者中,导致它们的临床预后（症状,急性加重,对治疗的反应,疾病进展速度或死亡）的不同,根据患者个体差异间的属性,将COPD分为不同表型。频繁急性加重表型为每年具有2次或2次以上急性加重,与非频繁急性加重表型相比,频繁急性加重表型患者的生活质量差,病死率增加,肺功能下降明显,预后差,因此,更值得我们关注。但对于慢阻肺频繁急性加重表型的发病机制的研究仍处于起步阶段,缺乏早期识别及防治的有效方法。因此,本研究基于频繁急性加重表型蛋白组学的研究结果,进一步通过体外细胞实验等方法,探讨前梯度蛋白3（anterior gradient3,AGR3）在COPD频繁急性加重表型发生发展中的作用机制。研究方法:第一部分:前梯度蛋白3在COPD频繁急性加重表型中的表达1)采用免疫荧光和免疫组化技术,确定AGR3在吸烟对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组肺组织内表达位置和差异。2)采用Western Blot技术在蛋白质水平上检测吸烟对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组肺组织中表达差异。3)采用RT-PCR技术在m RNA水平检测吸烟对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组肺组织中表达差异。4)采用ELISA法验证和比较AGR3在吸烟对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组血清中的表达差异。通过ROC曲线分析该生物标记物模型的准确性、特异性和灵敏度。第二部分:AGR3通过调节紧密连接蛋白和黏附连接蛋白参与气道上皮细胞屏障功能的研究1)采用免疫组化技术确定连接蛋白Occludin、Zo-1和E-cadherin在吸烟健康对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组肺组织支气管上皮细胞中的表达情况。2)通过给予香烟提取物（cigarette smoke extract,CSE）刺激人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B构建体外CSE暴露上皮细胞损伤模型。3)在人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中通过慢病毒转染和质粒转染构建过表达和沉默AGR3模型,观察AGR3对CSE刺激后连接蛋白Occludin、Zo-1和E-cadherin的表达情况。第三部分:AGR3通过调节E-cadherin/β-catenin复合体的稳定性参与气道上皮细胞屏障功能的研究1)采用免疫组化技术确定E-cadherin和β-catenin在吸烟健康对照组、COPD非频繁急性加重表型组及COPD频繁急性加重表型组肺组织内表达的差异。2)采用western blot和RT-PCR技术分析检测不同浓度香烟提取物建立构建CSE暴露上皮细胞损伤模型中E-cadherin和β-catenin的表达。3)在人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中通过慢病毒转染构建过表达的AGR3模型,通过免疫共沉淀技术检测E-cadherin和β-catenin的相互作用情况。结果:第一部分:前梯度蛋白3在COPD频繁急性加重表型中的表达1)通过免疫荧光和免疫组化技术,明确AGR3表达在人肺组织支气管上皮细胞内,发现与COPD非频繁急性加重表型相比较,AGR3在COPD频繁急性加重表型的肺组织支气管上皮细胞内表达下降。2)通过Western Blot技术发现与COPD非频繁急性加重表型相比较,AGR3在COPD频繁急性加重表型肺组织中的表达下降。3)通过RT-PCR技术发现与COPD非频繁急性加重表型相比较,AGR3 m RNA转录水平在COPD频繁急性加重表型肺组织中的表达量下降。4)采用ELISA法发现AGR3存在人血清标本中,与COPD非频繁急性加重表型相比,AGR3在COPD频繁急性加重表型组血清标本中表达量下降。通过ROC曲线分析提示AGR3生物标记物模型的准确性、特异性和灵敏度较高。第二部分:AGR3通过调节紧密连接蛋白和黏附连接蛋白参与气道上皮细胞屏障功能的研究1)通过免疫组化技术,明确连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1与COPD非频繁急性加重表型相比较,在COPD频繁急性加重表型组肺组织气道上皮的表达下降。2)香烟提取物构建体外CSE暴露上皮细胞损伤模型,结果显示5%以上的CSE浓度对BEAS-2B细胞活力有明显的抑制作用,通过western blot和RT-PCR技术,明确在10%浓度CSE刺激下48小时,连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的蛋白和m RNA水平均明显表达下降。3)通过慢病毒转染和质粒转染构建AGR3的过表达和沉默的BEAS-2B细胞,明确在AGR3的过表达BEAS-2B细胞中连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的表达升高,而在AGR3沉默的BEAS-2B细胞中连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的表达下降。分别在AGR3过表达和对照空载BEAS-2B细胞中,加入10%CSE培养48h,结果发现,AGR3过表达可缓解10%CSE刺激引起的E-cadherin,occludin和ZO-1表达的下降。第三部分:AGR3通过调节E-cadherin/β-catenin复合体的稳定性参与气道上皮细胞屏障功能的研究1)采用免疫组化技术,明确E-cadherin和β-catenin在COPD频繁急性加重表型组肺组织气道上皮的表达下降。2)采用western blot和RT-PCR技术,明确E-cadherin和β-catenin的蛋白水平在10%CSE处理组明显下降,β-catenin的m RNA水平表达在5%CSE处理组开始出现下降。3)通过慢病毒转染和质粒转染构建AGR3过表达和沉默的BEAS-2B细胞模型,明确在AGR3过表达BEAS-2B细胞中E-cadherin和β-catenin的蛋白表达升高,而在AGR3沉默的BEAS-2B细胞中E-cadherin和β-catenin的蛋白表达下降。通过免疫共沉淀技术,明确在AGR3过表达BEAS-2B细胞中E-cadherin和β-catenin蛋白的相互作用增强。结论:1.AGR3表达在人肺组织支气管上皮细胞内,在COPD频繁急性加重表型患者肺组织中蛋白表达和m RNA转录水平均下降,在患者血清样本中存在表达,且表达量下降,AGR3该生物标记物模型准确性、特异性和灵敏度较高,仍需大样本血清进一步验证明确限定值。2.与COPD非频繁急性加重表型相比较,连接蛋白E-cadherin,occludin ZO-1在COPD频繁急性加重表型组肺组织气道上皮的表达下降。10%浓CSE构建的体外上皮细胞损伤模型中连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的蛋白和m RNA转录水平均明显表达下降。AGR3过表达的BEAS-2B细胞中,连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的表达升高,而AGR3沉默的BEAS-2B细胞中连接蛋白E-cadherin,occludin和ZO-1的表达下降。AGR3过表达可缓解10%CSE刺激引起的E-cadherin,occludin和ZO-1表达的下降。3.与COPD非频繁急性加重表型相比较,E-cadherin和β-catenin在COPD频繁急性加重表型组肺组织气道上皮的表达下降,AGR3过表达BEAS-2B细胞中,β-catenin蛋白表达升高,而AGR3沉默的BEAS-2B细胞中β-catenin蛋白表达下降。AGR3过表达主要通过增强E-cadherin调节E-cadherin和β-catenin的相互作用。