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目的:本研究采用细胞培养、流式细胞术(FCM)、实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCT)、Westen Blot蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附实验(ELISA)等多种实验技术和方法检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者成骨细胞的数量、功能及相关信号通路,初步揭示成骨细胞在MDS中的异常变化,并进一步探索成骨细胞在MDS造血功能异常机制中可能的作用。在体外实验中显示,MDS患者成骨细胞数量减少,功能下降,信号通路异常,对正常干细胞的数量、质量产生不良影响,可能在MDS发生、发展,及其转化为急性髓系白血病中起重要作用。背景:MDS是以老年人为主要发病人群的造血干细胞恶性克隆性疾病,其特点是造血功能低下,转化为急性髓系白血病的风险增加。近年来的研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSC),如造血干细胞(HSC)与恶性克隆异常相互作用,造血细胞生长因子和细胞因子异常分泌等的改变,有助于MDS的发病机制。研究发现,间充质细胞在骨髓微环境,包括成骨细胞和骨细胞、网状细胞和脂肪细胞,在造血调控中发挥重要作用。成骨细胞是干细胞早期分化的关键。作为骨髓微环境的重要组成部分,成骨细胞在MDS的疾病发生、发展中起重要的作用。材料与方法:本实验选取2015年9月至2017年2月天津医科大学总医院血液科初治MDS患者38例。所有患者均按照2008版WHO关于MDS的诊断标准,并依据WPSS评分(表6)将病例组分为Group1(WPSS:0~2分,中低危组)18例和Group2(WPSS:3~6分,高危组)20例。正常对照组25名。应用骨髓培养法,体外培养MDS患者成骨细胞,并检测其数量功能。将正常骨髓单个核细胞分别与MDS患者及正常对照组成骨细胞混合培养后,检测HES1、Cyclin D1等信号通路靶基因的变化,并于体外培养干祖细胞集落,检测集落形成数目。磁珠分选正常对照组CD34~+细胞,分别加入MDS患者及正常对照组成骨细胞进行混合培养,应用FCM检测白血病干细胞(LSC)细胞比例、细胞凋亡比例。应用FCM、RT-PCT检测Jagged1、HES1、Cyclin D1等信号通路中关键基因,ELISA法检测MDS患者骨髓上清液及成骨细胞培养液中TGF-β的表达水平,Western blot免疫印迹法检测成骨细胞β-catenin/磷酸化β-catenin蛋白水平。探索并初步阐明MDS患者成骨细胞的异常变化及成骨细胞在MDS骨髓微环境中的作用。结果:第一部分、采用骨髓培养法,条件培养基,在MDS患者骨髓中,可体外培养并纯化出成骨细胞。MDS患者(6.29±6.57%vs13.01±6.29%,p<0.05)尤其是高危MDS(5.39±5.96%vs 13.01±6.29%,p<0.01),骨髓中成骨祖细胞数量较正常对照组减少。高危组MDS患者成骨细胞数量(4.62±0.62 vs 6.79±0.79,p<0.05)减少。MDS患者(3.61±0.47%vs 6.55±1.46%,p<0.05)尤其高危组(2.83±0.44%vs 6.55±1.46%,p<0.05)MDS患者成骨细胞中OCN~+CD34~-LIN~-比例明显低于正常组,其表达的骨形成蛋白2(BMP2)较正常对照组(2.51±0.51 vs 4.37±1.14,p<0.05)明显减低。MDS患者正常功能成骨细胞比例,于其骨髓中原始细胞呈反比,于其外周血中性粒细胞绝对值及血红蛋白浓度呈正比。第二部分、正常骨髓细胞,分别与MDS患者及正常成骨细胞共培养后,进行干祖细胞培养,MDS组干祖细胞集落形成较正常组减少,其中CFU-GM形成明显少于正常组(6.5±3.57 vs 17.9±7.11,p<0.01)。MDS组中骨髓细胞HES1(3.90±1.23 vs 1.72±0.49,p<0.05)及CyclinD1(20.24±5.00 vs 6.80±2.85,p<0.05)两个肿瘤相关基因表达增高。分选正常人CD34~+细胞,分别与MDS患者及正常成骨细胞共培养后,检测其凋亡MDS组较正常组增高(19.51±5.89%vs5.84±4.15%,p<0.001),而LSC比例MDS组明显增加(6.80±0.89%vs 2.50±1.56%,p<0.001)。第三部分、MDS患者成骨细胞Jagged1(24.34±13.27%vs 12.54±5.89%,p<0.05)、RANKL(3.68±2.60 vs 2.24±2.09,p<0.05)及HES1(3.23±0.78 vs 1.71±0.44,p<0.05)、CyclinD1(6.17±1.34 vs2.02±0.73,p<0.05)表达增高。在培养体系中加入了Notch通路抑制剂DAPT后,其靶基因HES1表达明显下降(3.39±0.85 vs0.38±0.15,p<0.01),而Wnt通路的靶基因CyclinD1表达增高(9.15±2.27 vs48.40±6.82,p<0.01)。MDS患者骨髓上清(268.98±113.19 vs 366.96±218.64,p<0.05)及成骨细胞培养液中(50.49±27.49 vs 80.54±29.11,p<0.05)TGF-β含量较正常降低,治疗后,骨髓CR患者的TGF-β含量上升,在骨髓上清中甚至超过了正常对照组的水平(600.21±404.95 vs 366.96±218.64,p<0.05)。β-Catenin在MDS患者成骨细胞中的表达增高,磷酸化β-Catenin是其活化形式,表达增高尤其明显。结论1、采用骨髓培养法,应用条件培养基,在MDS患者骨髓中,可体外培养并纯化出成骨细胞。MDS患者骨髓中成骨祖细胞数量较正常对照组减少。MDS患者成骨细胞数量减少,成骨能力较正常对照组明显减低且与临床指标相关。2、MDS患者成骨细胞,增加骨髓细胞中HES1、CyclinD1表达,抑制正常骨髓干祖细胞的分化增殖,并可诱导恶性克隆性细胞的产生。3、MDS患者骨髓及成骨细胞培养液中,TGF-β含量降低,成骨细胞RANKL、Jagged1及HES1、Cyclin D1表达增高,β-Catenin表达增高,相关信号通路被激活。4、MDS患者成骨细胞发生数量、功能、信号通路的异常变化,并可能因此改变了MDS患者骨髓微环境。