生物钟是一种进化上保守的计时机制,它使得生物体能够预测环境变化并调整它们的行为、生理以及生化反应以适应环境。目前认为,生物钟运行的分子机制是转录-翻译负反馈环路（transcriptional translational feedback loops,TTFLs）,主要是由正性调控元件CLOCK和BMAL1,以及负性调控元件PER（period）和CRY（cryptochrome）等转录因子组成,它们之间的相互作用构成了一个自我维持的负反馈环路。然而,以过氧化物酶（peroxiredoxin,PRDX）氧化形式的振荡为代表的非转录依赖振荡现象的发现引起人们对昼夜节律分子机制的重新思考,但是氧化还原系统是否能够直接参与昼夜节律的调控还不清楚。在本研究工作中,我们发现由昼夜节律性的内源性过氧化氢（hydrogen peroxide,H202）介导的CLOCK蛋白的氧化还原修饰,在氧化还原振荡与TTFLs之间建立了更为直接且重要的联系。首先,在哺乳动物中,我们发现无论是在培养的细胞还是在小鼠的肝脏组织中,内源性H202的水平呈现为近日节律性振荡。为了寻找H2O2的振荡与TTFLs之间的直接耦合点,我们采用catTFRE（concatenated tandem array of consensus TF response elements）的方法对在体内能够感受H2O2调节的转录因子进行筛选,鉴定到TTFLs核心转录因子CLOCK的DNA结合活性能够被H202显著激活,并且CLOCK蛋白的氧化还原状态呈现昼夜节律性振荡的形式,其下游钟控基因的mRNA水平能够被H202处理显著上调。为了探究H2O2介导的氧化还原修饰所发生的位点,我们对CLOCK蛋白N-末端的8个半胱氨酸残基进行了点突变和质谱实验,发现195位半胱氨酸（C195）是对于H2O2最敏感的半胱氨酸之一。为了确定C195是否介导体内CLOCK蛋白氧化还原状态的节律性振荡,我们使用CRISPR/Cas系统构建了半胱氨酸突变为丝氨酸（C195S）点突变小鼠（Clock 95S）,分别检测了野生型小鼠与C195S点突变小鼠的成体成纤维细胞中（mouse adult fibroblasts,MAFs）CLOCK蛋白的氧化还原状态,发现在ClockC195S-MAFs中其节律性发生明显改变,表明CLOCK蛋白的C195位点介导了体内CLOCK蛋白氧化还原状态的节律性振荡。接下来探究了CLOCK蛋白的氧化还原修饰对其蛋白质功能有何影响,通过对CLOCK/BMAL1的晶体结构进行分析,发现C195位于CLOCK与BMAL1形成异二聚体的界面上,在C195上发生的氧化还原修饰可能会影响CLOCK与BMAL1之间的相互结合。为了验证以上推测,我们采用WT-CLOCK、C195S-CLOCK与BMAL1纯化蛋白进行了一系列体外的生化实验,发现H202处理后能够显著增加WT-CLOCK/BMAL1之间的结合能力以及其与G-Box探针之间的结合能力,而对于C195S-CLOCK/BMAL1却没有明显的影响。综上所述,CLOCK蛋白上氧化还原敏感的195位半胱氨酸能够影响CLOCK/BMAL1的二聚形成以及其转录活性。而且与WT-MAFs相比,ClockC195S-MAFs中CLOCK下游钟控基因（clock control genes,CCGs）的转录振荡水平以及模式都发生了改变。对细胞节律的检测也进一步证实了 CLOCK中氧化还原敏感的195位半胱氨酸残基对生物节律的重要性。通过以上的研究发现,我们得到结论,由昼夜节律性振荡的H2O2介导的CLOCK蛋白的节律性氧化修饰,将氧化还原振荡与昼夜节律转录时钟机制联系在一起,共同构成细胞内基本的计时成分。这些发现表明,哺乳动物中内源性H2O2水平的昼夜节律性振荡具有重要的生物学功能,并且CLOCK蛋白节律性的氧化还原修饰在联结氧化还原信号振荡和TTFLs之间起着关键作用。