论文部分内容阅读
目的:本试验以研究绵羊支原体肺炎的抗病分子机制为目的,通过生物信息学的方法筛选,以期得到与MBL抗绵羊支原体肺炎相关的差异microRNA(miRNA)及基因,确定靶基因的生物学功能,并在细胞水平上进行验证,深入研究其在绵羊支原体肺炎中的调控机制,为丰富抗支原体肺炎的分子机制奠定基础。方法:(1)miRNA在MBL抗绵羊支原体肺炎中可能起到关键作用,利用生物信息学方法联合分析本课题组前期研究建立的高通量测序数据库和转录组测序数据库,筛选差异表达的miRNA及基因,TargetScan等软件预测差异表达miRNA的靶基因。(2)分别构建含有靶基因TRAF6 3’-UTR区的野生型和突变型的报告基因,利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System验证miR-509-5p对靶基因TRAF6的靶向调控作用。(3)呼吸道黏膜上皮是绵羊支原体肺炎的关键宿主,通过原代培养绵羊呼吸道黏膜上皮细胞,将miR-509-5p mimic、miR-509-5p mimic NC、miR-509-5p inhibitor以及miR-509-5p inhibitor NC转染至该细胞内,利用qRT-PCR方法分析miR-509-5p对细胞中靶基因TRAF6以及NF-κB信号通路相关基因的表达调控作用。(4)对易感型绵羊呼吸道黏膜上皮细胞转染miR-509-5p mimic和miR-509-5p mimic NC,在进行MO攻毒感染实验,利用ELISA方法以及qRT-PCR方法分析该处理对NF-κB通路中细胞因子、TRAF6等基因的影响。结果:(1)利用生物信息学方法联合分析后,对miRNA如oar-miR-10b,oar-miR-509-5p,oar-miR-432等进行实时荧光定量试验证实,说明高通量测序的数据库结果是可靠的,对miRNA进行靶基因预测,联合分析转录组数据库发现TRAF6和STAT2是差异表达的靶基因,GO富集和KEGG分析得知差异表达的miR-509-5p可能在炎症反应中发挥一定的作用。(2)根据筛选得到的结果,发现TRAF6可能是miR-509-5p的靶标基因。miR-509-5p mimic的转染显著降低了TRAF6基因的野生型质粒表达的荧光素酶活性,突变型没有显著变化。说明oar-miR-509-5p与TRAF6基因间存在靶向关系。(3)miRNA在绵羊呼吸道黏膜上皮细胞中过表达能显著下调TRAF6的mRNA表达,而抑制miRNA表达后则上调TRAF6的表达。过表达miR-509-5p显著提高NF-κB通路中TLR4、IRAK4的mRNA表达,TAK1基因显著下调,极显著下调NF-κB的mRNA表达;抑制则显著提高NF-κB的mRNA表达,极显著提高TAK1的mRNA表达。(4)PI染色法检测细胞死亡率发现,MBL蛋白对MO感染的细胞具有一定的保护作用。MO感染呼吸道黏膜上皮细胞,过表达miR-509-5p,发现炎性因子IL-12、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达受到抑制;miR-509-5p可能靶向结合TRAF6从而影响下游基因的表达。结论:(1)成功筛选与MBL抗绵羊支原体肺炎相关的差异miRNA和差异表达的靶基因。(2)证明了TRAF6基因是miR-509-5p的直接靶基因。(3)证明了miR-509-5p可能靶向TRAF6并影响NF-κB信号通路下游基因和细胞因子的表达,实现对NF-κB通路的负向调控作用。