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生长激素促分泌素受体(ghrelin receptor, GHSR)是一个由366个氨基酸组成的多肽,属于G-蛋白偶连受体(GPCR)家族,拥有7次跨膜结构。生长激素促分泌素是一种主要在胃部产生的含有28个氨基酸的多肽,该多肽被证实是GHSR的内源性配体。研究表明GHSR在促进生长激素(growth hormone, GH)的分泌、调节摄食、能量代谢及胃肠运动和分泌等方面发挥重要作用。生长激素促分泌素对于调控猪的生长有重要意义,但对其研究仅限于GH分泌、胃肠活动、心血管功能和细胞增殖方面。在人类、鱼和鸟类对生长激素促分泌素的研究中发现了许多其他生物学功能及其作用机制,但这些在猪上仍是未知的。因此,为进一步了解猪GHSR,本研究通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应(SOE-PCR)克隆出猪GHSR的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了猪GHSR的真核表达载体。为更深入的了解猪GHSR功能,我们选取了6个突变位点即P108L、I134T、V1601、 C173R、A204D和F279L,通过单点突变得到这6个突变体,将这7个真核表达载体(pGHSR WT、P108L、I134T、V160I、C173R、A204D和F279L)分别瞬时转染人胚肾细胞(HEK293T),用Western blotting检测WT及6个突变体的总蛋白表达情况。同时用荧光素酶报告基因法检测WT与6个突变体的Ca2+水平基值；然后,再选用不同配体作用于细胞,通过用微孔板检测仪检测荧光素酶的表达量,反映配体作用于受体后细胞内Ca2+水平的变化情况。结果如下：1、根据NCBI公布的猪GHSR编码序列设计2对特异性引物,由猪的基因组DNA扩增猪GHSR编码区,克隆得到的猪GHSR编码区为1101bp,编码366个氨基酸。将猪GHSR片段以T4DNA连接酶连接于真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)-myc/pGHSR。2、设计包含突变位点的正、反向引物,选择全式金公司的Fast Mutagenesis System点突变试剂盒以pcDNA3.1(+)-myc/pGHSR WT质粒为模板进行单点突变,获得6个突变型pGHSRs,分别为P108L、I134T、V160I、C173R、A204D和F279L。3、将带有野生型和突变型pGHSRs基因的真核表达载体以脂质体法转染HEK293T细胞,提取总蛋白,用鼠myc一抗和羊抗鼠IgG-HRP二抗,Western blotting检测总蛋白表达。结果显示,6种突变体的总表达量较WT而言均有减少,其中P108L和F279L的表达量轻微减少,A204D表达量明显减少,C173R的表达量最低。4、用成功表达野生型和突变型pGHSRs基因的真核表达载体与带有PGL3载体的荧光素酶报告基因共转染HEK293T细胞,检测细胞中Ca2+水平；同时还分别选用了一种激动剂和一种反向激动剂在共转染后进行刺激,再检测Ca2+水平的变化情况。结果显示,pGHSR本身具有较高的基础活性,与WT相比,P108L,V160I和F279L突变体的基础活性明显下降,C173R与A204D突变体的基础活性基本消失。在激动剂Hexarelin刺激下,WT的Ca2+水平随着Hexarelin浓度的增加而递增,P108L、V160IF279L突变体的Ca2+水平也与Hexarelin的浓度呈正比。1134T突变体虽然有较高的基础活性,但是对Hexarelin刺激后Ca2+水平并没有显示有所增加。相反,A204D突变体虽检测不到基础活性值,但是在Hexarelin刺激后Ca2+水平显著增加。结果还表明,Hexarelin刺激对C173R突变体的Ca2+水平无影响。在反向激动齐SP-analog刺激下,WT的Ca2+水平随着SP-analog浓度的增加而递减,P108L、1134T、V160I和F279L突变体的Ca2+水平也与SP-analog的浓度呈负相关。而SP-analog刺激对A204D和C173R突变体的Ca2+水平无影响。