论文部分内容阅读
研究目的:1、对常用DN大鼠模型的建立方法进行筛选并优化,为SKI防治DN药效学研究奠定基础。2、采用大鼠DN模型及体外细胞模型,评价SKI对DN的治疗作用并探讨其作用机制,为SKI的临床应用提供理论基础。3、对SKI中大黄蒽醌成分进行定性、定量分析为揭示其物效机制及二次开发提供依据;观测SKI中主成分(大黄素、大黄酸)对肾小球系膜细胞的作用,明确SKI的功效成分,揭示其可能的作用机制。研究方法:一、DN动物模型的研究(1)采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导I型DN大鼠模型并分别对STZ的使用剂量进行筛选。(2)采用高脂饲料联合STZ30mg/kg体重建立II型DN大鼠模型并分别对高脂饲料使用周期进行探讨。(3)采用单侧肾切除或单侧肾结扎并联合STZ30mg/kg体重建立DN大鼠模型并对肾结扎与切除两种方法进行探讨。二、SKI对DN大鼠的作用及机制研究(1)采用腹腔注射STZ65mg/kg建立SD大鼠I型DN模型及高脂饲料饲养4周并联合腹腔注射STZ30mg/kg建立SD大鼠II型DN模型。将DN模型大鼠随机分成肾康高剂量组(给予SKI10mL/kg,2次/d,i.p.);肾康中剂量组(给予SKI5mL/kg,2次/d,i.p.);肾康低剂量组(给予SKI2.5mL/kg,2次/d,i.p.);在I型DN大鼠实验中阳性药物胰岛素组(10U/kg,2次/天,i.m),在II型DN大鼠实验中阳性药物胰岛素组(4U/kg,2次/天,i.m);模型组(生理盐水,5mL/kg,2次/d,i.p.)。设置正常组给予生理盐水(5mL/kg,2次/d,i.p.)。分别于给药前及给药后第2、4、8周眼底静脉丛取血检测血肌酐、尿素氮、甘油三酯、糖化血红蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指标。第8周,取1mL血于肝素抗凝管内,于4℃冷冻离心机2000转/分,离心10min,后取上清;分别检测血清中T-SOD、CAT、NO、NOS及MDA;动物处死取肾脏称重、定点取材实施肾脏组织病理学检查。(2)采用高糖(含葡萄糖25mmol/L)培养肾小球系膜细胞建立DN细胞模型并分为肾康高剂量组(高糖培养基含SKI100mg/L);肾康中剂量组(高糖培养基含SKI50mg/L);肾康低剂量组(高糖培养基含SKI25mg/L)。并设置低糖组(含葡萄糖5.6mmol/L)及甘露醇组(低糖培养基+19.6mmol/L甘露醇)。探讨SKI对高糖培养的肾小球系膜细胞的抑制作用。三、SKI中大黄蒽醌类成分的定性、定量分析及活性研究(1)通过三氯甲烷多次萃取SKI中大黄蒽醌成分进行定性、定量分析,并采用岛津LC2010-AT高效液相色谱仪;色谱柱为StamsiL-BP C18(250mm×4.6,5μm);流动相:A(甲醇)-B(0.2%磷酸水溶液),梯度洗脱0-25min,A:75%-100%;检测波长440nm;柱温:30℃;流速1mL/min;进样量:20μL。(2)高糖(25mmol/L葡糖糖)培养肾小球系膜细胞建立DN细胞模型,分别给予大黄酸(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L)及大黄素(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L);采用MTT、流式细胞术、透射电镜和western blot方法,检测或观察大黄素和大黄酸分别对系膜细胞增殖、细胞周期和凋亡、细胞结构以及bax、caspase-3、caspase-6、caspase-8蛋白表达等影响。结果及结论:采用腹腔注射STZ65mg/kg体重建立大鼠I型DN模型,模型成功率高,且对动物损伤小;高脂饲料饲养4周联合腹腔注射STZ30mg/kg体重建立大鼠II型DN模型,周期短,模型成功率高且经济;单侧肾结扎联合腹腔注射STZ30mg/kg建立DN大鼠模型对动物损伤小,动物死亡率相对较低。SKI各剂量组均明显降低血肌酐、尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量(P<0.05);升高DN大鼠血中高密度脂蛋白含量(P<0.05);显著抑制肾脏肥大(P<0.05)。与模型组比较,SKI显著升高血清中T-SOD、CAT活力(P<0.05);明显降低血清中NO、NOS及MDA含量(P<0.05)。肾组织病理学检查证实,SKI各剂量组均能明显改善肾脏损伤,缓解肾小球硬化及间质纤维化。体外研究证实SKI能够显著抑制肾小球系膜细胞增殖,促进系膜细胞凋亡,影响系膜细胞周期中DNA合成阶段。SKI中五种蒽醌类成分的含量顺序为芦荟大黄素>大黄素>大黄酸>大黄酚>大黄素甲醚。通过对三批次含量分析证实芦荟大黄素的含量为23.20±1.36μg/mL,大黄酸为11.19±2.00μg/mL,大黄素为12.50±2.49μg/mL;大黄酚为7.10±1.49μg/mL;大黄素甲醚为1.51±0.21μg/mL。体外实验发现大黄素和大黄酸各浓度组均能明显抑制高糖培养的肾小球系膜细胞增殖,其机制可能与抑制肾小球系膜细胞周期、促进细胞凋亡有关.