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目的：肺癌中最常见的是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，目前手术切除是对其治疗的最有效方法。然而，多数患者在肿瘤发现时已处于临床中、晚期，失去了手术时机，另外即使接受了外科治疗的患者也常需要化疗辅助。因此，化疗仍是目前临床治疗NSCLC应用最广的手段。然而，传统化疗药物因特异性差、毒副作用大临床应用中受到了很大的限制。分子靶向治疗克服了传统化疗的缺点，近年来在肿瘤治疗的应用范围越来越广。以吉非替尼（gefitinib,ZD1839, Iressa）为代表的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶受体抑制剂（epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是用于治疗NSCLC最成功的分子靶向药物。它能通过与EGF竞争EGFR结构域中高度保守的ATP结合位点，选择性抑制EGFR酪氨酸激酶活性，阻止EGFR及其转导系统的启动，使RAS/RAF/MAPK转导系统不能被活化，进而抑制肿瘤细胞增殖。研究表明对EGFR-TKI敏感的NSCLC常有EGFR18、19、21位外显子突变，而这些突变多见于亚裔、女性、非吸烟患者的腺癌；相反，EGFR-TKI耐药NSCLC则常携带EGFR第20位外显子或K-RAS、B-RAF等基因部分外显子的突变。值得注意的是随着EGFR-TKI用药时间的推延，一些原本对该药敏感的NSCLC也会产生获得性耐药，而获得耐药也是用该药治疗失败的主要原因。探讨NSCLC EGFR-TKI获得性耐药的发生机制已成为该药临床应用中亟待解决的问题。传统化疗药物耐药机制包括耐药相关蛋白表达上调、错配修复功能异常、细胞药物外排及解毒作用增强、细胞药物作用靶点变化等，但EGFR-TKI获得性耐药发生机制可能难以用传统化疗药物耐药机制解释。文献报道NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药机制主要有以下几种：EGFR20外显子继发突变，引起EGFR的构象改变，使EGFR-TKI失去了作用靶点；K-RAS和（或）B-RAF基因外显子突变，引起信号传导通路下游分子的自身活化或敏感性增强；癌组织通过上皮-间质转化，失去上皮组织特性，使药物失去作用靶点；其它癌基因如MET基因扩增。以上这些机制的产生，特别是基因突变常与细胞的DNA修复功能异常，如错配修复功能异常有关。要研究这些机制，体外EGFR-TKI获得性耐药模型必不可少，目前国内这类模型很少。本研究中我们自建了肺腺癌细胞株NCI-H1975的EGFR-TKI获得性耐药细胞株NCI-H1975/gefitinib resistance（NCIH1975/GR），并通过比较耐药细胞株与亲本细胞株EGFR、P-EGFR、K-RAS、B-RAF、E-cadherin及MMR等蛋白的表达变化情况，希望为探讨NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药产生机制提供一点数据。方法：1.EGFR-TKI获得性耐药细胞株NCI-H1975/GR的建立人肺腺癌细胞株NCI-H1975购自中国医学科学院基础研究所，用EGFR-TKI代表药gefitinib以逐步递增浓度、间歇作用体外诱导法建立EGFR-TKI获得性耐药细胞株NCI-H1975/GR；MTT法检测耐药细胞株的耐药指数；倒置显微镜下观察亲本细胞株和耐药细胞株药物作用前后的细胞形态学变化；细胞计数法描绘耐药细胞株和亲本细胞株的生长曲线及群体倍增时间；流式细胞仪分析细胞周期分布。2.EGFR-TKI获得性耐药细胞株NCI-H1975/GR的蛋白检测免疫细胞化学法检测耐药细胞株与亲本细胞株中EGFR、P-EGFR、K-RAS、B-RAF、E-cadherin及MMR等蛋白表达，通过比较二者蛋白的表达差异，探讨NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药产生机制。结果：1.历时6个月建立的人肺腺癌EGFR-TKI耐药细胞株NCIH1975/GR对gefitinib的耐药指数为1.282；耐药细胞株NCI-H1975/GR细胞与NCI-H1975相比形态上存在差异，耐药株细胞体积略小，多数呈长梭形，有的变为圆形或纺锤形；耐药细胞株NCI-H1975/GR的群体倍增时间较亲本株NCI-H1975延长7.14小时（P<0.05）；流式细胞仪检测结果显示耐药细胞株NCIH1975/GR细胞G1期占81.11%、S期占14.63%、G2期占4.26%，亲本株NCI-H1975细胞G1期占49.80%、S期占42.20%、G2期占8.00%。2.免疫细胞化学显示：（1）NCI-H1975与NCI-H1975/GR细胞均有EGFR、P-EGFR蛋白表达,细胞膜和细胞浆表达，在两细胞株细胞膜的表达强度相近，但在细胞浆的表达耐药株NCI-H1975/GR均强于亲本株NCI-H1975；（2）NCI-H1975与NCI-H1975/GR细胞均有K-RAS表达，细胞浆表达，但在NCI-H1975/GR细胞的表达弱于NCI-H1975细胞；（3）NCI-H1975与NCI-H1975/GR细胞均有B-RAF表达，细胞浆表达，但在NCI-H1975/GR细胞的表达弱于NCI-H1975细胞；（4）NCI-H1975与NCI-H1975/GR细胞均有E-cadherin表达，但表达部位不同；NCI-H1975细胞的E-cadherin表达主要在细胞膜，而NCI-H1975/GR细胞的E-cadherin表达主要在细胞浆，在细胞膜的明显减弱；（5）NCI-H1975与NCI-H1975/GR细胞均有错配修复蛋白hMSH2表达，细胞浆和细胞核表达，在NCI-H1975/GR细胞的表达于NCI-H1975细胞；结论：1、获得性耐药细胞株细胞的EGFR、P-EGFR蛋白表达均增强；2、获得性耐药细胞株细胞的K-RAS、B-RAF蛋白表达均减弱；3、获得性耐药细胞株细胞的上皮性标记物E-cadherin表达减弱，这一发现提示上皮分化减弱可能是非小细胞肺癌产生EGFR-TKI获得性耐药的原因之一；4、获得性耐药细胞株细胞的hMSH2蛋白表达减弱，这提示错配修复功能异常可能是非小细胞肺癌肿瘤细胞产生EGFR-TKI耐药的原因之一。