纳豆激酶的基因克隆及其在家兔体内的药代动力学研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenzeqian
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开展了枯草杆菌纳豆激酶的基因克隆及序列分析:用CTAB法从枯草杆菌中提取DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得约1.3kb片段,在T4 DNA 连接酶作用下,将扩增片段连接到pUCm-T载体上,转化Ecoli DH5α菌。在含氨苄青霉素(AMP)和加IPTG+X-Gal的培养基上筛选,挑选白菌落快速提取质粒鉴定重组子,将初步鉴定的阳性细菌提取质粒DNA进行PCR鉴定和测序,序列分析结果证明获得了包含全部读码框的1278bp的纳豆激酶基因,和Genebank报道的纳豆激酶基因比较,有一个碱基由A变为G,密码子由原来的GAA变为GAG,但所编码的氨基酸都是Glu,其它序列除未测出部分外,与报道纳豆激酶基因相对应的碱基序列均相同。纳豆激酶基因的克隆为该酶成为基因工程药物奠定了基础。采用酶联免疫吸附法(ELISA)研究了纳豆激酶在家兔体内的药代动力学研究:建立了检测纳豆激酶浓度的方法,研究纳豆激酶(NK)静脉给药后在家兔体内的药代动力学参数。通过制备NK 抗血清,提纯NK 抗体并用辣根过氧化物酶标记,建立了夹心酶联免疫吸附法;取8只健康的普通家兔按0.00707g /kg给药,采血时间为开始给药后的5min、10min、20min、40min、60min、75min、120min、200min、270min、330min、420min、510min,用夹心酶联吸附反应检测血药浓度。实验结果表明所建立的夹心酶联免疫吸附法具有较高的特异性、重复性和灵敏度;所测的纳豆激酶在家兔体内的药时曲线符合二室模型,在家兔体内的主要药动学参数为:分布相半衰期T1/2α(min)为21.36±2.081;消除相半衰期T1/2β(min)为108.9±8.265;中心室分布容积Vd(L)为0.255±0.022;周边室分布容积V1(L)为0.089±0.005;药物总清除率CL(L/min)为0.0018±0.0004;药时曲线下面积AUC0-510 (mg/L*min)为4300.5±185.2;AUC0-∞ (mg/L*min)为4413.2±182.62。
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