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目的:近年来,甲状腺恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势,现已是全球范围内发病率上升最快的神经内分泌系统恶性肿瘤,在年轻女性中,其发病率超过乳腺癌,成为30岁以下女性最多见的恶性肿瘤。甲状腺恶性肿瘤可分为4个病理亚型,分别是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)、甲状腺滤泡状癌(folicular thyroid cancer,FTC)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer,MTC)及甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)。其中PTC是最常见的甲状腺癌病理亚型,约占全部甲状腺癌的80%~90%。大部分PTC患者在彻底的手术切除及放射性碘(radioactive iodine,RAI)治疗后预后良好,5年生存率超过95%。但其易发生早期淋巴结转移。且淋巴结转移是PTC患者预后的独立危险因素,这部分患者生存率骤降至40%。组蛋白甲基化异常是肿瘤发生、发展的常见原因。组蛋白去甲基化酶1A(KDM1A)可以与多种蛋白质复合物(Corest、NuRD和RCOR2)、受体(雌激素、雄激素和TLX)、非编码RNA(HOTAIR、SRA和Terras)、小RNA(miR-137和miR-329)、非组蛋白蛋白(p53、E2F1和DNMT1)和转录因子(TLA和Snail)等结合。这些复合物具有复杂的功能,能够调控多种生理和病理过程,包括癌症的发生和发展。目前KDM1A在前列腺癌、乳腺癌、口腔癌、大肠癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、急性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病等多种恶性肿瘤中异常表达。然而,KDM1A在PTC中的表达及功能尚不清楚。组织金属蛋白酶抑制剂家族(TIMPs)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的内源性抑制剂,这些内源性分泌蛋白能够抑制所有的MMPs,每一种TIMP都以多种MMPs为靶点,而每种MMP都有广泛的蛋白质底物,因此,TIMP介导的MMP抑制可以在调控体内稳态时形成一个强有力的联级体系。最新的研究表明,TIMP1在肺癌、脑癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌及其他许多恶性肿瘤中异常表达。但TIMP1在甲状腺肿瘤中的作用鲜有报道。本研究主要目的是探讨KDM1A在PTC组织及对应的癌旁组织中的表达及其对PTC细胞功能的影响。证实KDM1A能够通过作用于TIMP1发挥其在PTC中促进肿瘤迁移、侵袭的作用,并进一步解释KDM1A调控TIMP1的具体机制。方法:1.收集2014年9月至2017年2月在中国医科大学第一附属医院甲状腺外科接受手术治疗,且术前未接受其他治疗的60对PTC及配对的癌旁非癌组织。用qRT-PCR的方法在16对PTC及相应癌旁组织中检测常见KDMs的表达情况,将有表达差异的指标样本数扩大到60对。qRT-PCR方法明确60对PTC组织及对应的癌旁组织中其表达,收集2011年至2017年间患者的石蜡切片,其中包括61对配对的PTC及癌旁组织和94例PTC组织。行组织免疫化学染色,并统计患者临床资料。χ~2检验分析PTC患者石蜡切片标本中KDM1A的表达与临床病理资料的关系。应用qRT-PCR及Western blot方法检测KDM1A在正常甲状腺滤泡上皮细胞及4个PTC细胞系中的表达。2应用RNAi的方法下调KDM1A的表达,设计2条干扰序列(si-KDM1A(1)、si-KDM1A(2))并使用qRT-PCR及Western blot的方法检测干扰效率。Transwell及划痕实验检测下调KDM1A后对PTC细胞迁移和侵袭能力的影响。裸鼠尾静脉肺转移模型在动物体内验证KDM1A下调对PTC细胞转移及侵袭能力的影响。3.qRT-PCR及Western blot法检测KDM1A下调后对侵袭相关蛋白的影响。明胶酶谱法检测金属蛋白酶活性。qRT-PCR和Western blot检测干扰KDM1A后TIMP1的表达。共转染si-KDM1A及si-TIMP1,应用Western blot检测下游侵袭相关蛋白的表达,明胶酶谱法检测金属蛋白酶MMP2及MMP9活性。Transwell及细胞划痕实验检测共转染si-KDM1A及si-TIMP1对PTC细胞迁移和侵袭的影响。Western blot实验检测下调KDM1A后H3K4me2及H3K9me2的总体变化。染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测KDM1A与TIMP1基因转录起始位点附近的结合情况。应用ChIP实验检测转染si-KDM1A后H3K4me2、H3K9me2与TIMP1结合情况的变化。结果:1.在16对PTC及对应的癌旁组织中检测常见KDMs的表达,发现KDM1A、KDM5A和KDM7A在PTC组织中升高。选取KDM1A为后续研究对象,结果显示KDM1A在60名患者癌组织中的表达明显高于对应的癌旁组织且KDMA,免疫组化结果与患者临床资料对比后显示,在KDM1A表达阳性的与PTC患者年龄小于55岁及肿瘤淋巴结转移呈正相关。在细胞系中,KDM1A在PTC细胞系TPC1、IHH-4及BCPAP中的表达高于正常甲状腺滤泡上皮细胞系N-thyori 3-1,而PTC细胞系K1中的表达低于N-thyori 3-1,但无统计学意义。2条KDM1A干扰序列均能够有效敲减KDM1A的表达。2.Transwell及划痕实验结果显示在PTC细胞系中下调KDM1A的表达能够抑制细胞的迁移及侵袭能力,动物实验表明与尾静脉注射sh-NC的裸鼠相比,注射sh-KDM1A的裸鼠肺表面形成的肿瘤数量明显减少。3.下调KDM1A的表达后可以在蛋白水平降低侵袭相关蛋白MMP9的表达及活性。且MMP家族的内源性抑制剂TIMP1在mRNA水平和蛋白水平均明显上升,挽救实验表明共转染si-KDM1A和si-TIMP1的PTC细胞与单纯转染si-KDM1A的PTC细胞相比,可以部分恢复MMP9的表达及活性,且因KDM1A下调而引起的PTC迁移及侵袭能力的抑制得到一定程度的恢复。转染si-KDM1A后细胞H3K4me2,H3K9me2蛋白的总体表达下降,ChIP实验证实KDM1A与TIMP1基因转录起始区域直接结合,且与转染si-NC的细胞相比,转染si-KDM1A的细胞在TIMP1转录起始位点区域与之结合的H3K4me2明显升高,但H3K9me2并无明显变化,说明KDM1A是通过调控H3K4me2的去甲基化进而调控发挥作用。结论:组蛋白特异性去甲基化酶KDM1A通过与TIMP1转录起始位点区域结合,使H3K4me2去甲基化,抑制其转录,减少TIMP1的表达进而增加MMP的表达及活性,促进PTC的转移。