研究背景帕金森病是患病率最高的运动障碍性疾病,以静止性震颤、运动迟缓和肌强直为主要临床症状,通常也合并嗅觉障碍、便秘、睡眠障碍和抑郁等非运动症状。从有无遗传背景可以分为家族性和散发型,家族性帕金森病与基因突变密切相关,常见的基因包括LRRK2、SNCA、VPS35、EIF4G1、PARK2、PINK1、DJ-1等。散发型帕金森病的发病机制尚不清楚,年龄是帕金森病最主要的危险因素,患病率随年龄的增长而显著增加,另外某些职业暴露也是引起帕金森病的主要原因,例如杀虫剂、除草剂和重金属等。目前帕金森病的主要治疗原则是综合药物治疗,在帕金森病后期药物控制不佳时可考虑手术治疗并辅以康复心理治疗等,药物治疗是目前最主要的治疗措施,但其仍然只是替代治疗不能根治帕金森病。帕金森病的主要病理改变是中脑黑质区致密部多巴胺能神经元的缺失和路易小体的沉积,具体机制被认为与氧化应激,线粒体功能障碍和蛋白质清除功能障碍等相关。线粒体功能障碍可以表现为线粒体外膜渗透导致神经元凋亡,同样蛋白质清除功能障碍是因为细胞自噬功能紊乱,同样会引起神经元自噬性死亡。因此,调节帕金森病中神经元凋亡和神经元自噬的途径将会是一个非常有效的神经保护措施。microRNA是一类高度保守的大约只有21-25个核苷酸的非编码单链RNA,通过在转录水平抑制靶基因的表达,参与调节体内几乎所有的生理病理过程,例如生长发育、增生、炎症、肿瘤和神经退行性病变等。microRNA的表达具有时间和空间特异性,在不同发育阶段、不同组织或者在病理条件下,某一个特定的microRNA其表达水平均存在差异。研究表明,microRNA与帕金森病密切相关,某些microRNA在帕金森病中表达异常,miR-7、miR-153、miR-34b和miR-34c在帕金森病中表达均显著下降,另外,某些microRNA能直接调控帕金森病相关基因的表达,例如miR-7和miR-153以alpha-突触核蛋白为靶基因。因此,microRNA可能是早期诊断帕金森病的一种敏感生物标志物,并且调控microRNA的表达有望延缓帕金森病的疾病进展。MiR-124是一个高度表达于神经系统内的microRNA,其表达含量比其他组织的100倍还要丰富,在例如脑脊髓炎和胶质瘤疾病等神经系统疾病中表达下降,同时对于缺血性脑损伤和卒中等疾病具有显著的神经保护作用。但是,miRNA-124在帕金森病中的表达变化以及其是否对帕金森病也具有神经保护作用均尚不清楚。因此,本课题拟在MPTP帕金森病模型中研究miR-124的表达变化,并探讨其是否参与调节帕金森病中多巴胺能神经元凋亡和细胞自噬过程,是否具有神经保护作用及具体机制。研究内容第一章miR-124在MPTP导的帕金森病模型中的表达及意义目的：检测MPTP诱导的帕金森病小鼠和MPP+处理的SH-SY5Y细胞中miR-124的表达方法：(1) MPTP连续腹腔注射5天构建帕金森病小鼠模型,按最后一次注射MPTP后的不同时间点(0天,1天,2天,4天,7天和21天)分组,收集各组小鼠中脑组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, RT-PCR扩增miR-124和U6。以U6为内参,采用2^-ΔΔCt法比较各组miR-124的相对表达量,另外收集正常组小鼠和21天MPTP小鼠中脑组织,以miR-124原位杂交联合TH组织免疫荧光染色评估中脑多巴胺神经元内miR-124的表达。(2)以不同浓度(0.25mM,0.5mM,1mM和2.5mM) MPP+处理SH-SY5Y细胞24小时后,或以1mM MPP+处理SH-SY5Y不同时间(0,6,12,24,48小时)后,收集细胞,提取总RNA,同样以qRT-PCR定量miR-124的表达。结果：相比于正常组小鼠,MPTP给药后所有时间点的小鼠中脑组织内的miR-124表达水平均显著性下降,miR-124原位杂交结果显示在MPTP帕金森病小鼠中脑保留的多巴胺能神经元内的miR-124信号更弱。相比于正常组,SH-SY5Y细胞被不同浓度的MPP+处理24小时后,miR-124的表达水平均显著性下降,而只有当MPP+处理SH-SY5Y细胞12小时以后, miR-124才开始显著性下降。结论：在MPTP诱导的帕金森病模型中,多巴胺能神经元的miRNA-124表达在早期即发生了显著性下降。第二章外源性miRNA-124对MPTP诱导的帕金森病的神经保护作用目的：探讨miR-124是否对MPTP帕金森病小鼠具有神经保护作用。方法：以miR-124激动剂在小鼠体内过表达miR-124,在MPTP注射前9天侧脑室置管,1周后开始经导管注射miR-124激动剂,2天后再开始腹腔注射MPTP,实验分为正常小鼠组,正常小鼠阴性对照剂组,MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组,MPTP帕金森病小鼠miR-124激动剂组,同样在不同时间点收集中脑组织。以TH免疫组织化学染色评估黑质区多巴胺能神经元的数量,以高效液相色谱测定中脑组织多巴胺含量。结果：经侧脑室注射miR-124后,相比于MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组,MPTP帕金森病小鼠激动剂组内的miR-124水平均显著升高,MPTP给药后1天(0.3850±0.065 vs 0.7550±0.045,95%置信区间为0.05951-0.6805), MPTP给药4天后(0.4050±0.025 vs 0.7450±0.055,95%置信区间为0.02951-0.6505),MPTP给药21天后(0.475±0.075 vs 0.820±0.09,95%置信区间为0.03451-0.6555)。相应地,TH免疫组织染色信号显著增强；体视学方法计数后,TH阳性细胞数量显著增加(2397.667±616.694 vs 6266±455.566,95%置信区间为1295-6442)；高效液相色谱发现miR-124激动剂显著减少了因MPTP造成的中脑组织内多巴胺水平下降(31.08±4.184 vs 75.53±9.209,95%置信区间为2.404-86.49)。结论：miR-124能有效的减轻MPTP帕金森病小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的缺失,减少中脑组织内多巴胺含量的下降,对于MPTP诱导的帕金森病小鼠有神经保护作用。第三章Bim是miR-124的一个靶基因目的：预测并验证miR-124的靶基因。方法：(1)以Target Scan预测miR-124的靶基因；(2)构建靶基因野生型和突变型荧光素酶报告质粒,将质粒和miR-124模拟物或阴性对照剂同时转染入HEK293细胞,48小时后读取荧光值,实验分为野生型质粒miR-124阴性对照剂组、野生型质粒miR-124模拟物组、突变型质粒miR-124阴性对照剂组和突变型质粒miR-124模拟物组；(3)另外在SH-SY5Y细胞内转染miR-124模拟物或阴性对照剂,实验分为正常细胞组,miR-124模拟物组和miR-124阴性对照剂组。24小时后,收集细胞,分别裂解收集蛋白和提取总RNA,以行westernblot和qRT-PCR实验检测各组靶基因的蛋白水平和mRNA水平。结果：(1) TargetScan软件分析,发现人Bim的mRNA 3-端非编码序列内有两个miR-124的结合位点,且在物种间高度保守；(2)荧光素酶报告基因系统发现miR-124与Bim基因的3、端非编码区相结合,相比于野生型质粒miR-124阴性对照剂组,野生型质粒miR-124模拟物组的荧光素酶效应显著下降(1.081±0.198 vs 0.3694±0.048,95%置信区间为-1.142～-0.2822)；(3)相比正常细胞组,miR-124模拟物组Bim蛋白表达显著下降.(0.61±0.06083,p<0.05),而miR-124阴性对照剂组Bim蛋白没有变化(1.033±0.04910,p>0.05)；同样地,miR-124阴性对照剂组的Bim mRNA表达水平为(1.029±0.1397),没有统计学意义,而miR-124模拟物组为0.6584±0.04156,显著下降了35%左右。结论：Bim基因是miR-124的一个靶基因,其表达受miR-124的调控。第四章miR-124通过Bim基因减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元的凋亡及其机制目的：探讨miR-124是否能减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元的凋亡,并阐明具体机制。方法：在MPTP注射前9天侧脑室置管,1周后开始经导管注射miR-124激动剂,2天后再开始腹腔注射MPTP,实验分为正常小鼠组,正常小鼠阴性对照剂组,MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组,MPTP帕金森病小鼠miR-124激动剂组,收集MPTP注射后1天后各组的中脑组织,提取总RNA,逆转录成cDNA, RT-PCR定量分析Bim基因的表达；收集MPTP注射4天后各组的中脑组织,分别提取总蛋白和线粒体蛋白,采用Western blot分析Bim、Puma、Noxa和Bid蛋白的表达和Bax蛋白在线粒体的表达,另外采用TH免疫组织染色联合尼氏染色,依靠凋亡细胞的形态学特征对中脑黑质区的凋亡细胞计数。结果：(1)相比于正常组小鼠,MPTP组小鼠一天后Bim基因mRNA增加了75%左右(1 vs 1.757)。而在MPTP模型组内,相比于阴性对照剂,miR-124激动剂能显著下降Bim mRNA的表达水平(1.757±0.213 vs 1.226±0.118,95%置信区间：-1.046～-0.0153)。(2) MPTP造模引起了Bim蛋白表达水平显著升高,并且miR-124激动剂则能显著减少MPTP引起的Bim蛋白表达增加(3.106±0.245 vs 1.947±0.344,95%置信区间-2.022～-0.2966)；MPTP并不能引起BH3-only蛋白Puma和Noxa的表达变化,只有Bid在MPTP造模后表达上升,但是miR-124激动剂并不能拮抗MPTP引起的Bid表达上升。(3)相比于正常组小鼠,MPTP帕金森病小鼠线粒体内Bax表达显著升高；而且在MPTP帕金森病模型组内,相比于miR-124阴性对照剂,miR-124激动剂显著降低了线粒体内Bax蛋白的表达(3.5±0.45 vs 1.887±0.243,95%置信区间为-2.612--0.6148). (4) MPTP帕金森病模小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡比例显著上升,并且miR-124激动剂能够有效的抑制神经元的凋亡(29.333±2.963 vs15.667±2.333；95%置信区间为-21.23～-6.104)。结论：外源性补充miR-124能减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元凋亡,其机制为通过特异性的抑制Bim的表达,进而减少Bax蛋白向线粒体转位,减轻线粒体外膜渗透,最终抑制神经元凋亡。第五章miR-124调节MPTP帕金病中自噬功能障碍及机制目的：研究miR-124是否能调节MPTP帕金病中自噬功能障碍,并研究其是否通过靶基因Bim起作用。方法：(1) MPTP帕金森病模型构建及分组,侧脑室注射miR-124激动剂方法同前,收集最后一次注射MPTP1天后各组的中脑组织,裂解组织提取总蛋白,以western blot分析自噬体分子标记LC3Ⅱ和溶酶体分子标记LAMP1的表达。(2)设计Bim特异性siRNA,将对照剂,miR-124和si-Bim转染进SH-SY5Y细胞6小时后,以PBS或者MPP+处理细胞24小时后,收集细胞,提取RNA行qRT-PCR实验检测Bim的表达,同时提取总蛋白和溶酶体蛋白,分别检测总蛋白中LC3Ⅱ、LAMP1的表达和溶酶体内Bax蛋白的表达,以lysotracker-red标记溶酶体以评估溶酶体膜渗透。(3)以1mM MPP+或者PBS处理SH-SY5Y24小时,收集细胞,提取总蛋白,以Beclin-1抗体免疫沉淀蛋白样品,western blot检测Bim表达,以评估Beclin-1与Bim的相互作用。结果：①相比于正常小鼠,MPTP帕金森病模型组小鼠中脑组织LC3 Ⅱ蛋白表达显著增加(1±0 vs 6.407±0.578)；在MPTP模型组内,相比于阴性对照剂,miR-124激动剂能显著减少LC3 Ⅱ蛋白表达(6.407±0.578 vs 3.7±0.684；95%置信区间-4.461～-0.9525)。同样地,MPTP减少了40%左右溶酶体分子标记LAMP的表达(1±0 VS 0.620±0.064),miR-124激动剂能显著降低溶酶体的缺失(0.620±0.064 vs 0.927±0.047；95%置信区间0.1295-0.4838)；②相比于正常组细胞,siRNA-Bim和miR-124模拟物对Bim都有显著的基因沉默作用(contr01 vs miR-124模拟物,1±0 vs 0.5068±0.07661,95%置信区间0.1992-0.7871；control vs siRNA-Bim,1±0 VS 0.3856±0.09973,95%置信区间0.3204-0.9083)。在MPP+刺激下,siRNA-Bim和miR-124模拟物都能显著减少MPP+刺激引起的Bim表达上升(control vs miR-124模拟物,2.185±0.3350 vs 1.232±0.171l,95%置信区间0.05941-1.847:control vs siRNA-Bim,2.185±0.3350 vs 0.6610±0.06937,95%置信区间0.6301～2.418);③正常SH-SY5Y细胞内,miR-124模拟物和siRNA-Bim并不影响LC3Ⅱ的表达(contr01 vs miR-124模拟物,1±0 vs 0.99±0.091,95%置信区间-2.691-2.671:control vs M-Bim,1±0 vs 1.023±0.104,95%置信区间-2.658-2.705),但在MPP+刺激组内,MiR-124模拟物和siRNA-Bim都显著抑制了LC3II的表达升高(control vs mi-R-124模拟物,11.333±1.068 vs 7.90±0.656,95%置信区间-6.115～-0.7521;control vs si-Bim,11.333±1.068 vs 6.933±0.956,95%置信区间-7.081～-1.719)；同样地,在正常细胞中沉默Bim基因不改变溶酶体分子标记LAMP1的表达(control vs miR-124模拟物,1±0 vs1.030±0.113,95%置信区间-0.2836～0.3436:control vs si-Bim,1±0 vs0.990±0.075,95%置信区间-0.3236-0.3036),但在MPP+刺激组内,沉默Bim基因显著减少了LAMP1的表达下降程度(control vs miR-124模拟物,0.510±0.104 vs 0.833±0.056,95%置信区间0.009762～0.6369；control vs si-Bim,0.510±0.104 vs 0.843±0.043,95%置信区间0.01976-0.6469)④正常情况下溶酶体内几乎检测不到Bax蛋白,但是经MPP+处理24小时后,溶酶体内Bax蛋白表达显著,不管是以miR-124或者si-Bim均可以显著抑制溶酶体内Bax蛋白的表达。正常情况下,miR-124与si-Bim均不改变Bax在溶酶体内的表达(control vs miR-124模拟物,4.367±0.423 vs 2.677±0.339,95%置信区间为-1.014～1.134；control vs si-Bim,4.367±0.423 Ks 2.293±0.300,95％置信区间为-1.068-1.081)；在MPP+处理组内,miR-124与si-Bim均显著下降了Bax在溶酶体内的表达(control vs miR-124模拟物,1.000±0.000 vs1.060±0.089,95%置信区间为-2.764～-0.6156:control vs si-Bim,1.000 ±0.000 vs 1.007±0.100,95%置信区间为-3.148～-0.9989);⑤ miR-124模拟物和si-Bim均能在一定程度上减少因MPP+引起的Lysotracker-red荧光信号的下降；⑥在正常细胞内,Bim蛋白与Beclin-1蛋白相互结合,而MPP+处理24小时后,蛋白间相互作用消失。结论：miR-124在MPTP帕金森病模型中通过抑制Bim蛋白的表达,减少Bax蛋白的溶酶体转位,从而减轻溶酶体膜渗透,减少溶酶体缺失和自噬体堆积,改善MPTP引起的细胞自噬功能紊乱,起到神经保护的作用。第六章miR-124参与维持SH-SY5Y细胞内的基础自噬水平目的：探讨在SH-SY5Y细胞内抑制miR-124后细胞基础自噬水平的变化。方法：在SH-SY5Y细胞转染miR-124抑制剂或阴性对照剂24小时后,收集细胞行Western blot或者电镜检测细胞基础自噬水平。结果：相比于阴性对照记组,miR-124抑制剂组Bim蛋白表达显著升高(1±0 vs1.370±0.07234,p=0.0362)；细胞内自噬体分子标记LC3 Ⅱ表达显著减少(1±0 vs 0.68±0.07095,p=0.0458)；电镜观察发现在miR-124抑制剂组内自噬体样的膜状结构数量减少。结论：正常SH-SY5Y细胞内内,抑制miR-124的表达后,Bcl2家族蛋白Bim表达升高,从而抑制了SH-SY5Y细胞的基础自噬水平。