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本研究在成功使用毕赤酵母表达猪α干扰素蛋白的基础上,对猪α干扰素的6个关键氨基酸的密码子进行毕赤酵母偏嗜性修饰,修饰后的猪α干扰素基因在毕赤酵母x-33中获得高效表达。经SDS-PAGE和Western blotting,确证表达产物为猪α干扰素蛋白。用紫外分光光度计法测定蛋白含量,基因修饰后的猪α干扰素蛋白含量为0.3975mg/mL,与修饰前的0.08mg/mL相比提高5倍。
为了比较基因修饰前后猪α干扰素蛋白对病毒的抑制作用,本研究在非洲绿猴肾细胞(Vero)、猴胚胎肾上皮细胞(Marc-145)和猪肾细胞(PK-15)测定了基因修饰前后猪α干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的活性。结果显示,相同体积时基因修饰猪α干扰素在Vero细胞中抗VSV的活性为1.370×109IU/L,比修饰前的4.04×106IU/L提高约300倍。蛋白含量相同时,基因修饰猪α干扰素蛋白在Vero细胞上抗VSV的活性为7.9×107IU/mg,比基因修饰前的抗病毒活性(8.6×106IU/mg)提高9.2倍。基因修饰干扰素在Marc-145细胞上抗PRRSV的活性为108～109IU/L,比修饰前的活性(106～107IU/L)提高10～100倍。基因修饰干扰素在PK-15细胞上抗TGEV的活性为108～109IU/L,比修饰前的107～108IU/L提高10～100倍。
为了放大猪α干扰素的培养量,对猪α干扰素的发酵工艺进行了探索。基因修饰的重组酵母菌,按照不同比例接种于BMMY培养基进行小量发酵、摇瓶发酵、发酵罐发酵,于30℃条件下诱导表达72～96h。大量发酵的最佳条件是:二级种子接种量为1:100、pH为6.0、溶解氧(DO)值为20％、搅拌速度为550r/min、发酵时间为72h。
甲醛灭活后的干扰素肌注44日龄健康断奶仔猪以检测猪α干扰素对猪只的安全性。结果显示,实验组和对照组体温都在39.6～40.8℃内波动,波动范围不超过2℃。精神、食欲、呼吸、饮水等方面的生理状态正常,无痉挛、咳嗽、震颤、瘫软、耸毛等症状,亦无死亡。实验组和对照组的肝、枯否氏细胞、脾、淋巴结、胸腺淋巴细胞、肾、胰、胃等主要器官或细胞未发生明显的形态学和组织病理学变化。这表明该剂量的干扰素对动物安全有效。
以抗病毒活性为108IU/L的干扰素于实验条件下对感染高致病性蓝耳病的病猪进行治疗研究。将20只经ELISA鉴定为蓝耳病抗体阴性的50日龄健康断奶仔猪,按照体重随机分为试验组A、B、C和对照组D,每组5只。用105TCID50的PRRSV强毒攻毒,24h后试验组A、B、C分别注射106IU、105IU、104IU剂量的猪α干扰素,1次/d,连续注射6d。结果显示,干扰素剂量为106IU、105IU、104IU试验组分别死亡1只、2只、1只,剩余猪只无临床症状;而攻毒对照组死亡3只,剩余猪只有典型的临床症状。死亡猪临床症状基本一致,耳朵、腹部和四肢出现发绀;病理剖检可见典型的间质性肺炎;病变组织的RT-PCR均能扩增出高致病性蓝耳病毒基因。研究结果表明,我们研制的猪α干扰素在实验条件下能有效控制高致病性蓝耳病的发展进程。
为了探索PRRSV感染猪注射猪α干扰素的免疫状态,我们于攻毒前后第0d、第7d、第14d采集干扰素试验组和攻毒对照组的血液,以流式细胞仪对猪只的T淋巴细胞亚群变化进行分析。结果显示,106IU的干扰素可提高机体CD3+、CD4+T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值,增强T淋巴细胞的功能。105IU、104IU剂量的猪α干扰素在PRRSV感染的初期,提高机体CD3+、CD4+、T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值,改善了机体的免疫状态,但第14d以后逐渐失去作用。结果表明,合适剂量的干扰素可在PRRSV侵入机体后改善机体的免疫状态,增强机体的免疫能力。
综上所述,本研究通过修饰猪α干扰素基因6个氨基酸的密码子,提高了猪α干扰素蛋白在毕赤酵母中的表达水平和体外抗病毒活性;在实验室条件下能够减少动物的死亡和疾病的发生进程,提高体内CD3+、CD4+、T淋巴细胞亚群的比例及CD4+/CD8+比值,这表明猪α干扰素是一种具有潜力的预防和治疗猪病毒性疾病的基因工程药物。