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犬细小病毒病(canine parvovirus disease, CPVD)是一种由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)感染引起的以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的病毒性传染病,该病传播速度快,各种年龄和性别犬均可感染,幼犬的死亡率高达70%,成年犬隐形带毒并持续向外界排毒的现象普遍存在,现已成为危害我国养犬业健康发展的重要传染病之一,因此,建立快速、准确的诊断方法对CPVD的防治至关重要。本研究旨在制备抗CPV单克隆抗体,建立CPVD双抗体夹心ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法,为CPVD的快速检测和诊断提供帮助。本文内容包括以下四个部分：试验一：犬细小病毒的分离及其VP2基因分子特征分析从犬细小病毒病免疫预防失败犬体内分离到一株犬细小病毒(CPV),命名为Js12。该病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3.0不能灭活病毒,pHH10.0可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可使病毒失活。序列分析,JS12属于CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,共编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%～99.6%和98.3%-99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%～99.7%和97.90%～99.7%之间,未显现明显地域差异；在系统遗传进化树上,16个中国分离株处于不同组,JS12与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系近于中国毒株。将JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构进行比较,发现有9处氨基酸残基发生突变,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中进行表达,重组VP2蛋白的分子量为67.0ku；用western blot分析,重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。试验二：犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立用纯化的犬细小病毒(CPV)免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选和克隆化,共获得8株能稳定分泌抗CPV单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为1A4、1G3、1G8、1E4、2H2、3A5、3F3和3H1,抗体亚类分别为IgG2bκ、IgG2bκ、IgG1κ、IgG1κ、IgG1κ、IgG1κ、IgG2aκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验(IFA)证明,8株mAbs均可与CPV发生特异性反应；免疫印迹(western blotting)分析,mAb-1A4和mAb-1G8能特异性识别CPV的VP2蛋白；ELISA相加试验证实,8株mAbs分别作用于不同抗原位点；抗病毒活性分析,mAb-3A5培养上清液中抗体的中和效价为210,腹水的中和效价为106,其它7株mAbs则没有中和活性。试验三：犬细小病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立将获得的8株mAbs两两进行配对,选取读值最高的一对,即以3A5作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的2H2作为检测抗体,建立检测CPV抗原的双抗体夹心ELISA方法。经过优化：mAb-3A5的最佳包被浓度为2.5μg/mL,最佳封闭条件为10%胎牛血清的PBST于4℃孵育过夜,最佳CPV孵育时间为37℃作用1h,检测抗体HRP-2H2的最佳稀释度为1：4000。特异性试验证明,该方法与F81细胞、犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬副流感病毒(CPIV)和犬冠状病毒(CCV)均无交叉反应；敏感性试验表明,本方法可检测到的CPV含量至少为102 TCID50/mL;重复性试验表明,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性。用该方法与PCR方法同时检测47份临床样品,结果符合率高达100%。说明本试验建立的双抗体夹心ELISA检测方法可用于CPVD的临床检测。试验四：犬细小病毒单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条的制备在已经建立的双抗体夹心ELISA检测方法基础上,选择mAb-2H2作为金标记抗体,mAb-3A5作为检测抗体,制备犬细小病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经过优化,金标记抗体2H2的最适pH为8.0,最适蛋白浓度为17μg/mL;制备硝酸纤维素(NC)膜时,mAb-3A5的最佳包被浓度为1.2mg/mL,质检抗体的最佳包被浓度为1.0mg/mL;制备玻璃纤维素膜时,金标记抗体2H2的最佳包被浓度为4.0μg/mL.特异性试验证明,该试纸条与F81细胞、犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬副流感病毒(CPIV)和犬冠状病毒(CCV)均无交叉反应；敏感性试验表明,该方法可检测到的CPV含量至少为102.5TCID50/mL;重复性试验表明,批内及批间变异均较小,具有较好的重复性。用该方法与双抗体夹心ELISA方法同时检测47份临床样品,结果符合率高达100%。说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条可用于CPVD的临床检测。