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类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病,其病理特征为关节腔内滑膜细胞的异常增殖及炎症细胞的浸润,致畸率很高,严重影响患者的生存质量和预期寿命。RA发病机制目前尚不十分明确,是世界范围内的研究热点及难点。研究者公认的是T淋巴细胞及细胞因子参与了整个发病过程,并在类风湿性关节炎的发病中起到重要作用。肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factora, TNF-a)是重要的炎症因子,它是由巨噬细胞／单核细胞活化后产生的多功能细胞因子,与包括类风湿性关节炎在内的众多自身免疫性疾病有密切关系。异常增生的成纤维样滑膜细胞(FLSs)会显著促进类风湿性关节炎的发病,其自身能够合成并分泌许多因子介导炎症反应,而且还能够活化T淋巴细胞。多项研究表明,通过阻断炎症细胞因子或细胞免疫,达到了缓解炎症并改善临床症状的目的。由于RA发病机制复杂,本研究将采用联合治疗方式,从而达到更好的治疗效果。我们通过引入了人源肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区(hTNFRⅡ)来中和TNF-a;人源细胞毒T细胞相关抗原4(hCTLA4)可以抑制自身反应性T细胞的活化,并使其进入无能；FasL通过上调Fas抗原调节的凋亡信号,从而诱导滑膜细胞凋亡,同时通过FasL功能域,诱导逃脱抑制的活化细胞凋亡从而实现多途径抑制和清除自身反应性T细胞。腺相关病毒载体(adeno-associated virus, AAV)具有免疫原性低、宿主范围广、可介导外源基因长期表达等特点,成为基因治疗中具有广阔前景的载体之一。本研究选用2型重组腺相关病毒载体(AAV2)构建了携带人源肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和免疫球蛋白Ig融合基因、细胞毒T细胞相关抗原4(CTLA4)和FasL的胞外区融合基因、以及含有两个融合基因的双融合基因。本研究基因设计上在hTNFR-Ig融合基因与hCTLA4-FasL融合基因间加入furin2A,它能够将双融合基因进行有效切割,表达后成独立的两种蛋白,使其更加有效的发挥作用,在确定构建的重组病毒序列和载体正确后,于体外验证独立共表达和对TNF-a的中和能力。研究表明重组腺相关病毒载体可以在体外表达所携带的人来源的双融合基因,并且可以有效中和人来源的TNF-a,同时证明中和人来源的TNF-a的能力稍强于中和大鼠来源的TNF-a的能力,为体内动物实验研究奠定了基础。