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盐害是影响植物生长的主要因素之一。植物受到盐胁迫时,Na~+在细胞质中大量累积导致胞质内K~+/Na~+离子平衡性遭到破坏,从而使细胞的生理生化代谢过程受到抑制。通过离子平衡调节来维持细胞质K~+/Na~+相对恒定是植物正常生长发育所必需的,也是植物盐适应性的决定因素之一。由于K~+、Na~+平衡调节机制复杂多样,利用盐生植物分离K~+、Na~+平衡调节基因,研究它们在盐分胁迫中的功能和分子机制是非常必要的。本文从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆了两种离子转运蛋白基因,液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)和高亲和性K~+转运蛋白基因(AlHAK1),并对其序列进行了分析。在此基础上,将AlNHX1和AlHAK1基因表达在烟草或酵母中,对转化体的耐盐功能和耐盐生理特性进行了研究。同时,通过分离AlNHX1基因的上游调控序列,对其转录表达调控机制进行了细致研究。本研究为离子平衡调节基因在植物耐盐基因工程,尤其是单子叶农作物的基因改良中的应用提供了有力的理论基础和实验依据。具体研究内容及结果如下:1.利用RT-PCR和RLM-RACE方法从獐茅中分离了液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)cDNA全序列(GenBank accession no.AY745739)。AlNHX1基因cDNA全长2706bp,其中5′非编码区387bp,3′非编码区696bp,编码区1623bp,编码一个540氨基酸的蛋白。AlNHX1基因所编码的蛋白序列与已知高等植物的NHX具有较高的同源性,疏水性分析显示该编码蛋白具有10个跨膜结构域。AlNHX1基因在獐茅基因组中存在2-3个拷贝。2.构建了pBI121-AlNHX1植物表达载体,利用农杆菌介导的转化方法将AlNHX1基因组成型表达在烟草中。PCR、Southern杂交和Northern杂交的结果表明AlNHX1基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。转AlNHX1基因烟草的耐盐性明显提高:转基因烟草可以在含有100-300mM NaCl的MS培养基中正常生根,而野生型烟草无法在含盐量超过150mM的MS培养基中生根。用不同浓度的NaCl处理30天后,转基因烟草生长状况明显好于野生型烟草,并且其单株干重显著高于野生型烟草。转基因烟草在盐胁迫下的相对电导率和细胞渗透压均低于野生型烟草。离子含量检测显示在盐胁迫下转基因烟草根部积累较多的Na~+,其根部和叶片K~+/Na~+均高于野生型烟草。3.Northern杂交结果显示AlNHX1基因的转录表达受到ABA、NaCl和干旱的正调节。在盐胁迫下,AlNHX1基因在根部的诱导表达量明显大于叶片部位。通过锚定PCR方法获得了AlNHX1基因转录起始位点上游的启动子区域2036bp(GenBank accession no.EF590262),顺式元件分析显示AlNHX1启动子中具有三个ABA反应元件(ABRE),两个脱水反应元件(DREB)。将AlNHX1启动子及其删除系列与GUS基因融合后在烟草中表达,GUS组织化学染色实验显示在转基因烟草的根、茎、叶部位均检测到GUS活性,而在繁殖器官中没有观察到GUS活性。GUS荧光定量分析显示位于AlNHX1启动子-607的ABRE元件和-1506处的DRE元件可能与AlNHX1基因响应ABA和干旱处理有关。另外,转基因烟草在盐胁迫下根部GUS活性的表达量明显增加,表明AlNHX1启动子可调控基因在植物根部的盐诱导表达。4.利用RT-PCR和RLM-RACE方法从獐茅中分离了高亲和性K~+转运蛋白基因的cDNA全序列AlHAK1(GenBank accession no.DQ645465)。AlHAK1基因cDNA全长2844bp,其中5′非编码区300bp,3′非编码区213bp,编码区2331bp,编码一个776氨基酸的蛋白。AlHAK1基因所编码的蛋白与芦苇和大麦的HAK1的同源性较高,疏水性分析显示该编码蛋白具有12个跨膜结构域。AlHAK1基因在獐茅基因组中以2-3个拷贝形式存在。Northern杂交结果显示AlHAK1基因在獐茅根部表达,并且其转录表达受到缺钾和NaCl的诱导。5.将AlHAK1基因编码区构建到酵母表达载体pYES2上,并转入高亲和性K~+吸收缺陷型酵母W△3中。AlHAKl基因在酵母中的表达可以恢复W△3在微摩尔级K~+浓度下的生长,并且有效地吸收K~+,K_m为8±0.8μM,表明AlHAK1介导高亲和性K~+转运。不同浓度的NaCl处理抑制了对照酵母W△3-YES的生长,但对W△3-HAK的生长影响不大。300mM NaCl介质中,W△3-HAK的生长基本不受10μM-100mM K~+浓度变化的影响,而W△3-YES的生长明显受到抑制,表明AlHAK1还可能介导低亲和K~+转运。6.构建了pBI121-AlHAK1植物表达载体,利用农杆菌介导的转化方法将AlHAK1基因组成型表达在烟草中。PCR、Southern杂交和RT-PCR分析表明AlHAK1基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。耐盐生理实验表明转AlHAK1基因烟草的钾营养和耐盐性都有一定程度的提高:转基因烟草顶芽可以在含有100-250mM NaCl的MS培养基中正常生根,而野生型烟草无法在含盐量超过150mM的MS培养基中生根:50μM K~+水平下,转基因烟草的K~+含量是未转化烟草的2-3倍;转基因烟草在100-200mM NaCl条件下,发芽率明显高于对照烟草。不同浓度的NaCl处理一个月后转基因烟草的单株干重显著高于野生型烟草。在盐胁迫下,转基因烟草的相对电导率和细胞渗透压均低于未转化烟草。离子含量检测显示转基因烟草在盐胁迫下吸收较多的K~+从而维持根部和叶片中相对较高的K~+/Na~+。