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研究背景和目的
非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)是一种常见的人类恶性肿瘤。以细胞来源将NHL分为B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,BCL)、T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤三类,且BCL是常见的NHL类型,约占NHL总病例数的80%。以环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松和抗CD20利妥昔单抗靶向药物的综合治疗已成为BCL治疗的主流,虽改善了一些BCL患者的生活质量和远期预后。然而,仍然有部分BCL患者会出现复发转移。
研究发现,环状RNA(circular RNAs,circRNAs)在肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤中出现了异常表达,且能通过结合miRNA应答元件(microRNA response elements, MREs),进而解除miRNA对其靶基因的调控作用进而参与肿瘤发生发展。例如,circ-LAMP1在T细胞淋巴母细胞淋巴瘤组织中表达升高,升高其表达能促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。circ-LAMP1通过miR-615-5p靶向调节DDR2以参与淋巴瘤发生。我们课题组前期发现miR-148b-3p可直接靶向BCL-W,降低放疗照射后BCL细胞活力和集落形成,促进细胞凋亡。伴随着线粒体膜电位降低,细胞色素C释放,caspase9和caspase3裂解增多,与线粒体凋亡途径相关的蛋白表达升高。此外,miR-148b-3p可抑制辐照Raji细胞裸鼠移植肿瘤生长。利用基因芯片检测Raji细胞放疗前后差异表达的circRNAs,并筛选与miR-148b-3p具有作用靶点的circRNAs:hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353。本研究拟应用慢病毒转染技术、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)、CCK-8和流式细胞仪初步探究hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353对BCL细胞增殖、周期和凋亡的影响,为BCL患者的治疗提供新的治疗靶点。
研究方法
1、构建上调circRNAs表达的稳转B细胞淋巴瘤细胞
在BCLRaji细胞和SU-DHL-10细胞中,采用慢病毒感染上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_000935表达,并使用qRT-PCR检测Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji细胞/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNA表达组中的hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达量。
2、CCK-8检测过表达circRNAs对B细胞淋巴瘤细胞增殖的影响
Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNAs表达Raji/SU-DHL-10细胞组进行计数铺板,每孔2500个细胞,设置3个复孔;在0h、24h、48h和72h时分别加入10μl/孔的CCK-8试剂,37℃,5%CO2孵育2.5h后使用酶标仪检测细胞活性。
3、流式细胞分析仪检测过表达circRNAs对B细胞淋巴瘤细胞周期和凋亡的影响
Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNA表达Raji/SU-DHL-10细胞离心后按试剂盒说明书加入周期和凋亡试剂,并进行上机检测。
4、统计学分析
全部数据均以均数加减标准差表示,SPSS25.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料采取配对样本t检验或方差分析;计数资料组间比较实验数据采用卡方检验或Fisher确切概率法。对于不符合正态分布的实验数据采用秩和检验,显著性检验水平均以P<0.05为差异性标准。数据作图采用GraphPadPrism5.0作图。
研究结果
1、载体鉴定和慢病毒滴度
circRNAs过表达载体测序鉴定显示测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353成功插入载体中,表明过表达载体构建成功,且RNA电泳图显示28s,18s,5s条带清晰,RNA完整性良好。qRT-PCR结果显示circRNAs过表达H293T细胞组中hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353均表达升高,且具有统计学意义,表明载体构建成功。此外,慢病毒滴定结果显示:hsa_circ_0043415过表达慢病毒的滴度为:2×107TU/ml;hsa_circ_0010358过表达慢病毒的滴度为:5×106TU/ml;hsa_circ_00093535过表达慢病毒的滴度为:5×106TU/ml。
2、构建上调circRNAs的稳转B细胞淋巴瘤细胞模型
通过慢病毒颗粒转染Raji和SU-DHL-10细胞使circRNAs表达上调以构建稳转细胞株。qRT-PCR检测发现,与Raji和SU-DHL-10细胞空白组和慢病毒空载对照组(Vector)相比,hsa_circ_0043415过表达组(circ _0043415)、hsa_circ_0010358过表达组(circ_0010358)和hsa_circ_0009353过表达组(circ_0009353)中circRNAs表达明显升高,上述结果表明本模型构建成功,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。
3、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达促进B细胞淋巴瘤细胞增殖
CCK-8结果显示,随着时间推移,上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10组的OD(Optical density)值分别明显高于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05),而Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中检测OD值无明显变化(P>0.05)。
4、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达促进B细胞淋巴瘤细胞周期转变
流式细胞分析仪发现Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中G1期和S期无明显变化(P>0.05),而上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10细胞组的G1期比例分别低于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05),S期比例分别高于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05)。
5、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达抑制B细胞淋巴瘤细胞凋亡
流式细胞分析仪发现Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中凋亡率无明显变化(P>0.05),而上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10细胞组凋亡率分别低于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05)。
研究结论
Hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353促进BCLRaji和SU-DHL-10细胞增殖,可能机制是促进细胞从G1期向S期转变,并且减少细胞凋亡。hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_000935在Raji和SU-DHL-10细胞中作为类似于癌基因的作用,且与前期基因芯片结果相一致,表明抑制其表达可能改善BCL患者的预后。
非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)是一种常见的人类恶性肿瘤。以细胞来源将NHL分为B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,BCL)、T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤三类,且BCL是常见的NHL类型,约占NHL总病例数的80%。以环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松和抗CD20利妥昔单抗靶向药物的综合治疗已成为BCL治疗的主流,虽改善了一些BCL患者的生活质量和远期预后。然而,仍然有部分BCL患者会出现复发转移。
研究发现,环状RNA(circular RNAs,circRNAs)在肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤中出现了异常表达,且能通过结合miRNA应答元件(microRNA response elements, MREs),进而解除miRNA对其靶基因的调控作用进而参与肿瘤发生发展。例如,circ-LAMP1在T细胞淋巴母细胞淋巴瘤组织中表达升高,升高其表达能促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。circ-LAMP1通过miR-615-5p靶向调节DDR2以参与淋巴瘤发生。我们课题组前期发现miR-148b-3p可直接靶向BCL-W,降低放疗照射后BCL细胞活力和集落形成,促进细胞凋亡。伴随着线粒体膜电位降低,细胞色素C释放,caspase9和caspase3裂解增多,与线粒体凋亡途径相关的蛋白表达升高。此外,miR-148b-3p可抑制辐照Raji细胞裸鼠移植肿瘤生长。利用基因芯片检测Raji细胞放疗前后差异表达的circRNAs,并筛选与miR-148b-3p具有作用靶点的circRNAs:hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353。本研究拟应用慢病毒转染技术、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)、CCK-8和流式细胞仪初步探究hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353对BCL细胞增殖、周期和凋亡的影响,为BCL患者的治疗提供新的治疗靶点。
研究方法
1、构建上调circRNAs表达的稳转B细胞淋巴瘤细胞
在BCLRaji细胞和SU-DHL-10细胞中,采用慢病毒感染上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_000935表达,并使用qRT-PCR检测Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji细胞/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNA表达组中的hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达量。
2、CCK-8检测过表达circRNAs对B细胞淋巴瘤细胞增殖的影响
Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNAs表达Raji/SU-DHL-10细胞组进行计数铺板,每孔2500个细胞,设置3个复孔;在0h、24h、48h和72h时分别加入10μl/孔的CCK-8试剂,37℃,5%CO2孵育2.5h后使用酶标仪检测细胞活性。
3、流式细胞分析仪检测过表达circRNAs对B细胞淋巴瘤细胞周期和凋亡的影响
Raji/SU-DHL-10细胞、慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒上调circRNA表达Raji/SU-DHL-10细胞离心后按试剂盒说明书加入周期和凋亡试剂,并进行上机检测。
4、统计学分析
全部数据均以均数加减标准差表示,SPSS25.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料采取配对样本t检验或方差分析;计数资料组间比较实验数据采用卡方检验或Fisher确切概率法。对于不符合正态分布的实验数据采用秩和检验,显著性检验水平均以P<0.05为差异性标准。数据作图采用GraphPadPrism5.0作图。
研究结果
1、载体鉴定和慢病毒滴度
circRNAs过表达载体测序鉴定显示测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353成功插入载体中,表明过表达载体构建成功,且RNA电泳图显示28s,18s,5s条带清晰,RNA完整性良好。qRT-PCR结果显示circRNAs过表达H293T细胞组中hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353均表达升高,且具有统计学意义,表明载体构建成功。此外,慢病毒滴定结果显示:hsa_circ_0043415过表达慢病毒的滴度为:2×107TU/ml;hsa_circ_0010358过表达慢病毒的滴度为:5×106TU/ml;hsa_circ_00093535过表达慢病毒的滴度为:5×106TU/ml。
2、构建上调circRNAs的稳转B细胞淋巴瘤细胞模型
通过慢病毒颗粒转染Raji和SU-DHL-10细胞使circRNAs表达上调以构建稳转细胞株。qRT-PCR检测发现,与Raji和SU-DHL-10细胞空白组和慢病毒空载对照组(Vector)相比,hsa_circ_0043415过表达组(circ _0043415)、hsa_circ_0010358过表达组(circ_0010358)和hsa_circ_0009353过表达组(circ_0009353)中circRNAs表达明显升高,上述结果表明本模型构建成功,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。
3、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达促进B细胞淋巴瘤细胞增殖
CCK-8结果显示,随着时间推移,上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10组的OD(Optical density)值分别明显高于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05),而Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中检测OD值无明显变化(P>0.05)。
4、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达促进B细胞淋巴瘤细胞周期转变
流式细胞分析仪发现Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中G1期和S期无明显变化(P>0.05),而上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10细胞组的G1期比例分别低于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05),S期比例分别高于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05)。
5、上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353表达抑制B细胞淋巴瘤细胞凋亡
流式细胞分析仪发现Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞中凋亡率无明显变化(P>0.05),而上调hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353Raji/SU-DHL-10细胞组凋亡率分别低于Raji/SU-DHL-10细胞和慢病毒空载对照组Raji/SU-DHL-10细胞(P<0.05)。
研究结论
Hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_0009353促进BCLRaji和SU-DHL-10细胞增殖,可能机制是促进细胞从G1期向S期转变,并且减少细胞凋亡。hsa_circ_0043415、hsa_circ_0010358和hsa_circ_000935在Raji和SU-DHL-10细胞中作为类似于癌基因的作用,且与前期基因芯片结果相一致,表明抑制其表达可能改善BCL患者的预后。