研究背景:中枢神经系统肿瘤中最常见的是胶质瘤（Glioma）,约占颅内肿瘤的44.69%,居颅内肿瘤发病率的第一位。现阶段,肿瘤的治疗取得了巨大进步,然而胶质瘤治疗方面所取得的成绩难以令人满意,据统计其五年生存率仅约为5%。总体上看对于该类肿瘤的治疗尚缺乏特效方法,肿瘤病理生理学研究证实胶质瘤细胞因其过度增殖、对临近组织的恶性侵袭及多发性化疗药物耐药等病理机制是该病预后不良的主要因素,其中,过度增殖因素在胶质瘤复发过程中发挥作用最大。在脑胶质瘤的治疗方面虽然采取了放疗、化疗、手术等手段,但治疗效果仍不理想,因此近年来关于胶质瘤的分子治疗研究成为胶质瘤治疗领域中的热点。然而,对于胶质瘤发病因素及发病机理的认识目前仍然较为薄弱,因此探明胶质瘤的发病机制对于提出有效的分子靶向治疗具有重要的意义。在真核核细胞内主要启动两条途径来诱导蛋白的降解:其一,溶酶体途径,内化膜蛋白及被吞入胞内的外来蛋白的降解主要经此途径;其二,非溶酶体途径,此途径主要指导将一些被泛素结合修饰后的胞内蛋白进行降解。泛素为76个氨基酸所构建的蛋白,典型的蛋白泛素化过程需要先后经过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的作用进行顺序催化反应,研究发现E3决定了催化底物的特异性。在直接能源物质ATP参与下,泛素-蛋白酶体经泛素的修饰和引导,先后通过E1、E2、E3多步骤复杂的酶促反应,最终使底物蛋白质的特异性氨基酸残基被泛素所标记,从而完成了目标底物蛋白的泛素化。研究表明,大量的蛋白转录后的修饰过程均是通过泛素来进行的。泛素发挥作用机制主要是经三步酶促反应后使其与靶向蛋白上的特定氨基酸残基以共价键相联接。具体来讲,泛素激活酶E1使泛素活化,之后传递给泛素结合酶E2,最后通过泛素连接酶E3的连接作用实现泛素同底物蛋白的赖氨酸残基结合,从而实现了底物蛋白的整体泛素化过程。其中,E2决定泛素修饰反应类型,而E3具有底物特异性。基因工程科学的进展使泛素化精细机制进一步展现,被确定的E1酶有2种,E2酶50余种而E3酶的种类已经多达600余种。E3酶系家族成员可被分为 RING-finger 家族及 HECT（homologous to E6AP C terminus）家族,RING-finger家族的成员最多,其分子结构中所含的E2结合结构域均极其相似,也均发挥将活化泛素转移、连接至靶蛋白氨基酸残基的桥梁作用,该家族E3自身不直接同泛素起作用。HECT家族成员E3具有HECT催化结构域,这使的该类E3不仅直接同E2相结合,更会通过其分子结构中保守Cys残基同活化后的泛素经硫酯键相联接,整体上看,E2将泛素活化后传递给E3,最后由E3将之呈递给底物蛋白,使底物蛋白实现泛素化。随着基因科学、分子生物学技术的飞速发展,越来越多的泛素连接酶被不断发现,泛素化机制及其重要的生物学作用愈加引起相关学者的高度重视。泛素水解蛋白系统是调节蛋白质降解的一个重要途径,由于降解异常导致癌蛋白的积累往往会促进肿瘤的发生和发展。因此,泛素连接酶被人们认为是分子靶向治疗的一个重要靶点。截至目前,已经有多个针对泛素连接酶抑制剂被报道具有较好的抗肿瘤作用,如 Mdm2（Mouse double minute 2）和 NEDD8-Activating Enzyme（NAE）的抑制剂等。RNF126是环指泛素连接酶家族的一员,在其N末端包含一个锌指结构域,在C末端包含一个环指结构域。已有研究表明RNF126可能与肿瘤的发生密切相关,比如乳腺癌。我们的预实验结果显示RNF126在胶质瘤组织和正常脑组织表达存在较大差异,提示RNF126可能是调控胶质瘤发生的一个潜在蛋白。因此,RNF126在胶质瘤中的生物学作用和机制值得进一步研究。第一部分RNF126与p27在胶质瘤中的蛋白表达以及相关性研究目的观察RNF126与p27于人正常脑组织及不同恶性级别的脑胶质瘤组织中表达情况,探究此两种基因之间的表达相关性。方法该部分的研究分成正常脑组织组、Ⅲ级脑胶质瘤组和ⅣV级脑胶质瘤组共三个研究组,其中,正常脑组织标本均取自严重颅脑损伤后接受颅内减压手术患者的正常脑组织。采用Western Blot法检测人脑胶质瘤及正常脑组织内RNF126与p27的蛋白水平,其中胶质瘤和正常脑组织各7例,并进行统计学分析;并分析两种基因表达的相关性。另外,应用Western Blot方法检测了 RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中的表达情况。结果1.我们通过免疫印迹法分析了 RNF26和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中的表达情况,结果发现:非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有RNF126蛋白的表达,而与非瘤脑组织相比,脑胶质瘤中RNF126蛋白表达明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）。而p27的表达则与RNF26呈现一定的负相关关系,相关系数r=-0.71。2.我们分析了 RNF126在不同恶性程度的胶质瘤细胞系中的表达情况,结果显示RNF26在不同恶性程度的胶质瘤细胞中存在差异,恶性程度越高,RNF26的表达越高。结论1、RNF126和p27在非瘤脑组织及脑胶质瘤组织中均有表达。RNF126在脑胶质瘤中表达较非瘤组织中表达明显增加,且与细胞周期负调控因子p27呈现负相关性。2、RNF26在恶性程度越高的胶质瘤细胞系表达越高。第二部分RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的作用及其分子机制研究目的观察RNF126对胶质瘤细胞增殖能力的影响,探索其中存在的分子作用机制,为胶质瘤分子靶向治疗寻找潜在新作用靶点。方法 1.分子克隆技术构建LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒,并包装慢病毒侵染胶质瘤细胞,构建稳定沉默和过表达RNF126的细胞系。2.在构建的稳定细胞系中,进行EdU渗入实验、集落形成实验和MTT实验检测沉默和过表达RNF126的脑胶质瘤细胞增殖能力。3.运用免疫共沉淀技术和免疫印迹实验检测RNF126和p27的相互作用,以及p27的蛋白水平和泛素化水平的变化。结果（1）通过免疫印迹实验检测RNF126沉默效率,免疫印迹实验显示转染pLV-shRNF126#1组细胞中RNF126沉默效果达80%以上。随后应用LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126质粒包装慢病毒侵染胶质瘤细胞U251,免疫荧光观察示侵染效率在90%以上且沉默效果良好,提示U251-shRNF126沉默细胞系构建成功。（2）为了验证RNF126对脑胶质瘤细胞增殖的重要性,我们用U251-shRNF 126及U251-control细胞系进行了 EdU实验,EdU实验结果显示:U251-shRNF126增殖率较U251-control增殖率低57%。同时,利用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行细胞集落形成实验,其统计结果显示:U251-shRNF126细胞较U251-control克隆形成能力明显降低。另外,我们用U251-shRNF126及U251-control细胞系进行了MTT实验,MTT实验结果同EdU及集落形成实验研究结果一致,显示沉默RNF126后细胞增殖能力明显减弱。以上结果表明沉默RNF126后细胞增殖能力减弱,那么过表达RNF126后脑胶质瘤细胞增殖能力有何变化?为了进一步探讨RNF126对细胞增殖的影响,我们包装了GFP-RNF126和GFP慢病毒,并用慢病毒侵染U251细胞,构建U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系。免疫荧光实验显示侵染效率在90%以上。为了检测U251-GFP-RNF126细胞系中外源性RNF126表达情况,我们提取U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞蛋白,通过Western Blot实验检测示RNF126在U251细胞中能稳定表达,说明U251-GFP-RNF126和U251-GFP细胞系构建成功。为了进一步验证RNF126促进胶质瘤细胞增殖的作用,我们通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系中进行EdU实验。EdU检测结果显示U251-GFP-RNF126细胞增殖率较U251-GFP细胞增高110%。通过对U251-GFP-RNF126及U251-GFP细胞系检测细胞集落形成能力,其统计结果显示:U251-GFP-RNF126细胞较U251-GFP细胞克隆形成能力明显提高。MTT实验也显示U251-GFP-RNF126及U251-GFP较对照组增殖能力明显增强。以上实验结果表明RNF126可能在人脑胶质瘤细胞增殖中起着重要作用,沉默RNF126明显抑制胶质瘤细胞增殖,过表达RNF126则明显促进胶质瘤细胞增殖。（3）为进一步探讨RNF126究竟是通过何种分子机制来促进胶质瘤细胞增殖,我们首先在U251细胞中转染FLAG-RNF126后,通过免疫共沉淀技术验证了p27与RNF126的相互作用。实验结果显示在U251细胞中过表达RNF126可以与p27相互结合。进一步内源蛋白Co-IP证明细胞内源的RNF26同样可以与p27相互作用。（4）然后我们又发现,沉默RNF126明显上调p27的蛋白水平,而过表达RNF26则明显下调p27的蛋白水平。相应地,沉默RNF126明显减弱p27的泛素化,而过表达RNF26则明显增加p27的泛素化。最后我们证明RNF126介导的p27降解可以被蛋白酶体抑制剂MG132阻断。我们也试图做了体外泛素化实验,然而我们没有检测到p27的体外泛素化反应。这说明可能有其他一些因素参与到RNF126介导的p27泛素化过程中,比如p27的修饰,或者其他一些接头蛋白等。总之,我们的研究阐明了 RNF26在胶质瘤增殖中高表达,并且可以通过负调控细胞周期抑制子p27促进胶质瘤细胞的增殖。结论（1）在胶质瘤细胞中沉默RNF126细胞增殖能力明显减弱,而过表达RNF126细胞增殖能力明显增强。（2）RNF126可通过增强细胞周期负调控因子p27的泛素化和降解而促进脑胶质瘤细胞增殖。